李 勇 王莉華

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450000

研究表明miRNA 參與多種生物過(guò)程［1］，有許多關(guān)于miRNA 對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma，NB）組織下調(diào)機(jī)制的研究的報(bào)道［2－3］。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)miR－181c抑制NB細(xì)胞的生長(zhǎng)，然而，miR－181c對(duì)NB 的靶向調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.1 細(xì) 胞 系 和 轉(zhuǎn) 染 人 類NB 細(xì) 胞 系SK－N－SH 和SHSY5Y。MiR－181c模 塊，Smad7siRNA 和 反 義siRNA 購(gòu) 買 于上?；蛑圃旃?。基因編碼Smad7放大和插入pcDNA3向量（上 游：5“CGAAGCTTATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC 3”；下游：5“CCCTCGAGGGGCGCAGATCGTTTGGTCCTGAACAT 3”）。使用Lipofectamine TM 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（英杰公司）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2 綠色熒光蛋白報(bào)告基因分析 擴(kuò)增Smad7的野生型3‘UTR，并插入到pcDNA3／EGFP媒介的下游。Smad7DE 突變體3‘UTR（UGAAUGA 突變?yōu)锳GUAAGA）進(jìn)行擴(kuò)增，并克隆到載體pcDNA3／EGFP 的下游。對(duì)于EGFP 報(bào)告基因的分析，使用mir－181c模塊或ASO－mir－181c和野生型Smad7的3＇UTR 或突變體3＇UTR 進(jìn)行細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。RFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率增高。在轉(zhuǎn)染48h后，通過(guò)一個(gè)F－4500熒光分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定裂解的細(xì)胞和GFP密度。

1.3 免疫蛋白印跡分析 在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，密度為30×104個(gè)細(xì)胞／孔，并且在第2天細(xì)胞數(shù)量達(dá)到大約80%的時(shí)候進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h，用RIPA 緩沖液，在4度裂解細(xì)胞30min。使用BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并且用20μg的蛋白質(zhì)上樣來(lái)進(jìn)行SDS－PAGE分析。一抗是兔抗人Smad7的抗體（1：500，Abcam 公 司，美 國(guó)）和 兔 抗 人GAPDH 抗 體（1：1 000，Abcam 公司，美國(guó)）。二抗是羊抗兔IgG 結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶（1：1 000，Abcam 公司，美國(guó)）。使用的ECL Plus Western印跡檢測(cè)系統(tǒng)（GE Healthcare）檢測(cè)結(jié)合的抗體，并使用高性能的化學(xué)發(fā)光膜（GE Healthcare）上進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 RNA 的提取和實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)制造商的說(shuō)明方案，使用Trizol提取總的RNA。使用1μg的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對(duì)于miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用特定的miR－181c RT 引物，然后用于總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄，Oligo（dT）作為一個(gè)通用的引物。使用SYBR GreenPCR 混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。所有使用的引物如下：miR－181cRT primer：5’CTCAAC TGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；miR－181c forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’；Smad7sense：5’TCTGCTCCTGGATCTCCCTGA GATG 3’；Smad7antisense：5’GCTTGCTGGCCTAATAGCAGAGCTT3’。

1.5 腫瘤細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（MTT） 鋪96孔板，4000個(gè)／每孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48h 后，用MTT 培養(yǎng)4h。加入DMSO100μL，解除MTT 并將細(xì)胞放置搖晃10min。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值A(chǔ)（波長(zhǎng)570nm）。細(xì)胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.6 Transwell小室遷移試驗(yàn)和侵襲試驗(yàn) 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，消化細(xì)胞并離心收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度2.5×104）250μL 加入transwell上室，腔室底部則加入750μL的含有10%～20%血清的培養(yǎng)液。20h后取出transwell小室，使用棉簽輕輕擦拭小室上層細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定transwell小室。取出固定好的小室，使用自來(lái)水沖洗小室，結(jié)晶紫染色15min沖洗。將染好色的小室經(jīng)梯度酒精脫水，風(fēng)干后取下膜層，用中性樹脂封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)即可。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析選用SPSS 13.0軟件，所有數(shù)據(jù)采用mean±SD，兩組間比較采用雙樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mi－181c的直接目標(biāo)基因Smad7 為了探索mir－181c對(duì)NB 細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，使用生物信息學(xué)技術(shù)我們預(yù)測(cè)了mi－181候選目標(biāo)基因，認(rèn)為候選基因?qū)Π┯袧撛谧饔谩Ｎ覀兲暨x了Smad7，MAT2A，CDKN2AIP，TGFB1 當(dāng)作候選靶向基因。為了確定這些基因是否被mir－181c調(diào)控，我們首先檢測(cè)mir－181c控制3＇UTR 段綠色熒光蛋白的（Green Fluorescent Protein GFP）強(qiáng) 度。如 圖4B 示，mir－181c 減 少3＇UTR 段Smad7、CDKN2AIP 和TGFB1 的GFP 強(qiáng) 度，而MAT2A 除外。另外，蛋白印跡法（Western blot）分析表明，mir－181c蛋白水平上減少對(duì)Smad7 和CDKN2AIP 的表達(dá)，而對(duì)TGFB1 和MAT2表達(dá)增高。鑒于mir－181c對(duì)Smad7的表達(dá)影響較CDKN2AIP顯著，我們選擇了Smad7作為進(jìn)一步 研 究 對(duì) 象。Figure 1D 示，mir－181c 的 結(jié) 合 位 點(diǎn) 在Smad7 3＇UTR，而且產(chǎn)生了多個(gè)突變位點(diǎn)。我們用mir－181c對(duì)野生型／3＇UTR 段突變的Smad7重新轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)mir－181c減少Smad 3＇UTR 段GFP強(qiáng)度，對(duì)突變的Smad7 3＇UTR段GFP強(qiáng)度沒(méi)有影響。在蛋白水平上，mir－181c對(duì)Smad7 mRNA 的表達(dá)減少約40%。這些數(shù)據(jù)表明mir－181c直接靶向作用于Smad7，mir－181c可抑制Smad7的表達(dá)。

圖1 mi－181c的直接目標(biāo)基因Smad7

2.2 Smad7 介導(dǎo)mir－181c在NB 細(xì)胞中的抗腫瘤作用Smad7作為mir－181c的直接靶向基因，我們?cè)噲D確定mir－181c是否引誘Smad7可以調(diào)節(jié)其生物學(xué)行為，我們用mir－181c模塊和Smad7 過(guò)度表達(dá)載體pcDNA3／Smad7（無(wú)Smad7 3＇UTR）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，兩者均能控制Smad7表達(dá)量。通過(guò)Western blot和RT－PCR 驗(yàn)證了Smad7 的表達(dá)。MTT 和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析表明，Smad7過(guò)度表達(dá)可以恢復(fù)細(xì)胞活力，促進(jìn)遷移和侵襲能力。對(duì)修復(fù)細(xì)胞活性，遷移和入侵能力。此外，進(jìn)一步驗(yàn)證Smad7在NB 細(xì)胞中的作用，我們用siRNA 技術(shù)抑制了Smad7的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)Smad7的敲除抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，遷移和入侵。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，Smad7 蛋白可能作為的mir－181c在NB腫瘤發(fā)生的重要介質(zhì)。

圖2 Smad7介導(dǎo)mir－181c在NB細(xì)胞中抗腫瘤作用

3 討論

先前關(guān)于miR－181家族靶標(biāo)基因研究主要是5p段結(jié)合位點(diǎn)干擾基因的研究［4］，最近研究人員用信息預(yù)測(cè)靶點(diǎn)法預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步用突變3′段綁定結(jié)合位點(diǎn)干擾基因表達(dá)，檢測(cè)靶點(diǎn)位目的基因表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)miRNA－9靶定MMP－14基因3′段，并抑制其表達(dá)，對(duì)NB 起到抑制作用［5］。miR－181簇在癌癥中起到的不同作用主要取決于它的靶向基因，通過(guò)靶向基因調(diào)節(jié)miRNA 的功能。為了了解mir－181c在NB細(xì)胞系中的抑癌作用機(jī)制，進(jìn)一步研究靶向結(jié)合位點(diǎn)和堿基突變對(duì)基因表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)用EGFP 檢測(cè)3＇UTR段Smad7綠色熒光蛋白（GFP）強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)mir－181c結(jié)合位點(diǎn)在Smad73＇UTR 段，而且有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（本研究發(fā)現(xiàn)有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，Smad73＇UTR1460－1466），而且發(fā)現(xiàn)mir－181c對(duì)突變的Smad73＇UTR 段GFP 強(qiáng)度沒(méi)有影響（圖1），驗(yàn)證了Smad7是mir－181c的直接靶向基因，并確定了3＇UTR 段靶向位點(diǎn)，進(jìn)一步明確mir－181c對(duì)Smad7起負(fù)表達(dá)作用。

通過(guò)功能研究（圖2），證實(shí)Smad7 和pcDNA3／Smad7（Smad7超表達(dá)載體－無(wú)Smad7 3＇UTR）對(duì)NB細(xì)胞促進(jìn)生長(zhǎng)，遷移和入侵作用。本實(shí)驗(yàn)兩個(gè)細(xì)胞系均轉(zhuǎn)染Smad7和pcDNA3／Smad7后MTT／Transwell結(jié)果示對(duì)NB細(xì)胞有積極作用，重要的是mir－181c－mmics＋pcDNA3 組對(duì)NB細(xì)胞的抑制作用最顯著，說(shuō)明mir181c與超表達(dá)的Smad7 起到抑制NB細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和侵襲作用，由此可以說(shuō)明Smad7直接誘導(dǎo)mir－181c產(chǎn)生抗腫瘤作用。然而，以往研究結(jié)果表明，Smad7在EGF信號(hào)通路中起負(fù)性調(diào)控作用，在乳腺癌中抑制TGF－β1的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［6］，與本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)形成了鮮明的對(duì)比。這個(gè)結(jié)果表明，Smad7 具有組織特性，在不同腫瘤中起到不同的作用。由此我們可以假設(shè)，mir－181c可能在乳腺癌和NB中起到不同的作用。

實(shí)質(zhì)性證據(jù)表明，Smad的腫瘤抑制作用與TGF－β信號(hào)通路有關(guān)。Smad7在惡性腫瘤演變過(guò)程中的扮演不同的角色（抑癌／促癌）。Smad7通過(guò)防止信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的活化抑制TGF－β1通路［7］。Smad7具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用外，還能夠調(diào)節(jié)TGF／BMP 通路中Smurf遍在蛋白。Smurf2 連接到Smad7蛋白，降低信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Smad7的遍在蛋白化和降解Smad。然而，到目前為止Smad7的功能仍然不清楚。通 過(guò)抑 制TGF－β，Smad7 過(guò) 度 表 達(dá) 抑 制 骨 和 肺 轉(zhuǎn) 移［8－9］。Smad7同時(shí)通過(guò)減少M(fèi)MP－2和MMP－9的分泌［10］抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤發(fā)生。與此相反，Smad7的可誘發(fā)大腸癌轉(zhuǎn)移［11－12］。符合Smad7 在結(jié)直腸癌促轉(zhuǎn)移作用，我們的數(shù)據(jù)還表明，Smad7蛋白促進(jìn)NB 細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和侵襲。因此，Smad7蛋白功能機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，我們研究證明了mir－181c通過(guò)Smad7 的表達(dá)抑制，調(diào)控NB 細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，充當(dāng)一種腫瘤抑制基因。這些結(jié)果為基因治療NB患者奠定了重要基礎(chǔ)。

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