榮晶晶 和姬苓

【摘要】RNA干擾是近幾年興起的一種新技術(shù)，它是由雙鏈核糖核酸引起的抑制基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。這種新技術(shù)在抗病毒、抗癌癥和基因病等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。本文就RNA干擾的作用機制 、研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】RNA干擾技術(shù) 基因沉默 研究進(jìn)展

【中圖分類號】R9145 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0645-01

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高效特異地阻斷基因表達(dá)的新技術(shù)。RNAi 是指一些小的雙鏈 RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi) Dicer 內(nèi)切酶的識別、結(jié)合、酶切下，產(chǎn)生有活性的長度為 21～23nt 干擾性 RNA（short interfering RNA ，siRNA），與互補的目的基因的 mRNA 結(jié)合并使之降解，從而到達(dá)抑制目的基因表達(dá)的作用，是一種由雙鏈 RNA誘發(fā)的“基因沉默”現(xiàn)象。本文旨在講述RNA干擾的作用機制及研究進(jìn)展。

1. RNA干擾技術(shù)的作用機制

RNAi是指細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈 RNA （double—stranded RNA，dsRNA）片段，可致該mRNA發(fā)生特異性降解從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象[1]。其作用機制是：外源性 （如病毒）或內(nèi)源性的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)與一種具有dsRNA特異性的RNA酶Ⅲ內(nèi)切核酸酶 （RNaseUIendnuclease）——Dicer結(jié)合為酶dsRNA復(fù)合物 ，隨即被切割成21～23nt的RNA片段 ，即siRNA。siRNA與 Dicer形成 RISC。siRNA 作為引導(dǎo)序列，按照堿基互補原則識別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，并引導(dǎo)RISC復(fù)合體結(jié)合mRNA.隨后siRNA與mRNA在復(fù)合體中換位，核酸酶 Dicer將mRNA切割成21～23nt的片段 ，從而可以破壞特定目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，使其功能沉默，即基因沉默（gene silencing）。而新產(chǎn)生的siRNA片段可再次與Dicer酶形成RISC復(fù)合體 ，介導(dǎo)新一輪的同源mRNA降解 ，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng) ，顯著增強了抑制基因表達(dá)的作用

2. RNA干擾技術(shù)的臨床應(yīng)用與進(jìn)展

2.1抗腫瘤治療

2.1.1白血病的治療 化療在惡性腫瘤的治療中具有重要地位。很多學(xué)者致力于利用RNA干擾技術(shù)治療腫瘤，以解決多重耐藥性導(dǎo)致化療失敗的問題。例如，w0hlbold等[2]構(gòu)建了針對bcr—abl融合位點 b3a2的同源siRNA，研究結(jié)果表明特異性siRNA可以使過表達(dá) bcr—abl蛋白的細(xì)胞系（32Dp2102wt，M07P210，CD34 十 2CML細(xì)胞 ）的bcr—abl蛋白形成組顯著下降，并且長期用這種特異性 siRNA可以逆轉(zhuǎn) bcr—abl蛋白依賴性的細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)作用而且可以選擇性地抑制細(xì)胞生長，為進(jìn)一步探索慢性粒細(xì)胞白血病治療的新途徑提供了有利的實驗依據(jù)。

2.1.2治療乳腺癌 乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，有研究表明利用RNA干擾技術(shù)抑制可能導(dǎo)致乳腺癌的基因從而達(dá)到控制乳腺癌細(xì)胞的增殖，Jiang等[3]通過構(gòu)建靶向 MTA1 （ metastasis associate d-1）的短發(fā)夾RNA（ short hairpin RNA，shRNA） 并導(dǎo)入ER（ +） MCF-7 和 ER（ -） MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞。MTA1 下調(diào)后 ER（ -） MDA-MB-231 細(xì)胞重新表達(dá) ERα，增加了內(nèi)分泌治療的敏感性。同時降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （ matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 和 cyclin D1 的蛋白表達(dá)水平，使MDA-MB-231 細(xì)胞阻滯在G0/ G1期，但對MCF-7 細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯影響。靶向 MTA1 沉默能明顯引起兩種乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移抑制，RNA 靶向干擾 MTA1 基因可能具有乳腺癌治療效用。 Qiu等 [4]實驗研究表明，利用 siRNA的方法靶向沉默 cripto一1基因的表達(dá)可在一定程度上抑制人乳腺癌MDA—MB468細(xì)胞的侵襲，進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。另外，乳腺癌50% 的首發(fā)性和 80% 的復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移發(fā)生在骨骼中，Guo等提出靶向 BMP4 信號通路將成為乳腺癌治療的新手段，實驗中通過成功構(gòu)建靶向BMP4的siRNA并導(dǎo)入MCF-7 和MBA-MD-231細(xì)胞中，抑制了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，證明了 BMP4 在乳腺癌細(xì)胞中的作用； 同時發(fā)現(xiàn) MMP-1 和 CXCR4 的表達(dá)在 BMP4過表達(dá)的細(xì)胞中激增。

2.1.3其他腫瘤 腫瘤細(xì)胞可持續(xù)增殖，Zhou等[5]利用腺病毒介導(dǎo)的 RNAi轉(zhuǎn)染人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 Hecl能抑制腺癌腫瘤的生長和增殖并使其失去致瘤性。應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)將Akt1沉默，并成功轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株SGC-7901和BGC-823， 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)， Akt1沉默在體外和體內(nèi)環(huán)境下均可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鐘英強等研究發(fā)現(xiàn)，siRNA靶向沉默 hTERT基因的表達(dá)，可在一定程度上抑制人胰腺癌 Capan-2細(xì)胞 Bcl-2、環(huán)氧化酶 2基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤進(jìn)一步惡化[6]。在前列腺癌研究領(lǐng)域中，金鵬等[7]已率先采用RNA干擾技術(shù)， 將針對GSTP1設(shè)計的短發(fā)卡RNA轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞株Du145介導(dǎo)GSTP1基因沉默， 發(fā)現(xiàn)能明顯抑制癌細(xì)胞增殖。

2.2抗感染

RNA技術(shù)同樣可以用于病毒、寄生蟲甚至細(xì)菌引起的感染性疾病中，尤其是對抗病毒情有獨鐘，起初是在植物中發(fā)現(xiàn) RNAi的抗病毒作用，后來在動物中也發(fā)現(xiàn)相同的作用。近幾年RNA干擾機制在抗病毒感染的研究中取得了很大進(jìn)展。在病毒復(fù)制時，tat基因轉(zhuǎn)錄所必需的周期蛋白（cyclin）T1能夠顯著提高病毒基因表達(dá)水平。通過 RNAi的方法設(shè)計抑制 cyclinT1的表達(dá) ，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的。Deng等科學(xué)家致力于這方面的研究，最后的研究結(jié)果表明shRNA能夠阻斷乙型肝炎病毒DNA的表達(dá)與復(fù)制[8]。

2.3心腦血管疾病

2.3.心血管病 高血壓是最常見的心血管病，張敬群等[9]通過構(gòu)建兩腎一夾高血壓大鼠模型用攜帶U6啟動子和血管緊張素1受體短發(fā)夾RNA編碼序列的質(zhì)粒干擾AT1a受體，結(jié)果證實可有效抑制腎血管性高血壓進(jìn)展。在心肌病及心力衰竭的研究也有一定進(jìn)展，李凡東等[10]通過RNA干擾IK1表達(dá)，使其電流幅度明顯下降，有利的抑制了心機細(xì)胞IK1，為治療心肌病提供了新的方法。Watanabe等[11]將肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶（SERCA2a）的RNA轉(zhuǎn)染入新生小鼠心肌細(xì)胞，通過證實SERCA2a的mRNA和蛋白水平顯著下降，而鈣離子的吸收明顯提高。楊廣等[12]也在實驗中進(jìn)一步驗證了RNA可干擾心衰大鼠受磷蛋白mRNA的表達(dá)，改善心臟功能。

2.3.2腦血管病 2. 腦血管疾病致殘率、致死率極高，治療腦血管病成為了又一個研究重點?；虬悬c治療主要體現(xiàn)在動脈粥樣硬化方面。脂蛋白脂肪酶（LPL）在動脈粥樣硬化中的機制不完全清楚，因此脂蛋白脂肪酶成為治療動脈硬化的突破口。劉明等[13]利用 RNAi 技術(shù)在細(xì)胞水平抑制LPL 基因的表達(dá)，結(jié)果證實抑制率可達(dá) 70%以上。這一結(jié)果為以后控制和預(yù)防腦血管疾病提供了理論依據(jù)。洪濤等[14]應(yīng)用 RNAi 技術(shù)沉默平滑肌細(xì)胞間隙連接蛋白 43（ connexin43，Cx43）的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞間的通訊。在此基礎(chǔ)上，他們繼續(xù)采腺病毒介導(dǎo)的RNAi特異干擾腦血管痙攣 Cx43 的異常高表達(dá)，進(jìn)一步證實 Cx43 及縫隙連接在腦血管痙攣發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，也為探討腦血管疾病的基因治療做出貢獻(xiàn)。

2.4其他

還可用于遺傳病的研究中， RNAi在基因功能和相關(guān)方面的研究中具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢 ，因此許多遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家對此產(chǎn)生了極大興趣，RNA干擾技術(shù)成為了遺傳學(xué)研究的新方法。實驗研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)siRNA能夠直接作用于點突變的基因使其功能喪失降低突變，野生型基因卻不受影響，因為點突變引發(fā)的遺傳性疾病能夠通過應(yīng)用 RNAi技術(shù)降低突變方法進(jìn)行治療。例如 ，遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病Huntington病和 Alzheimer病的治療就可以通過RNAi技術(shù)，即在腦部局部注射siRNA進(jìn)行基因治療；再如應(yīng)用 RNAi技術(shù)治療常染色體顯性色素性視網(wǎng)膜炎 （adRP）的轉(zhuǎn)基因小鼠，取得了良好的效果。

3.研究進(jìn)展

siRNA 的這種非特異性反應(yīng)和 RNA 傳遞效率極大地影響著它的體內(nèi)應(yīng)用，但進(jìn)一步合理設(shè)計高效 siRNA 序列、開發(fā)在體內(nèi)具有長效功能的載體、完善更為特異性的體內(nèi)輸送途徑等將成為進(jìn)一步促進(jìn) RNAi 作為疾病治療策略的研究熱點。隨著 RNAi 機理的進(jìn)一步闡明，RNAi 技術(shù)將以驚人的速度向前發(fā)展，不斷取得突破，聯(lián)合多基因 RNAi 治療也將為基因治療開辟更廣闊的前景?？傊S著RNA干擾機制研究的深入和完善，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，必將大力推動人類疾病的治療和人類功能基因組學(xué)的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]Ashihara E，Kawata E，Maekawa T.Future prospect of RNA interference for cancer the rapies[J].Curr Drug Targets，2010，11（3）：345-360.

[2] Wohlbold L ，Van DerKuip H ，Miething C .et al.Inhibition of bcr—abl gene expression by small interfering RNA sensitizes for imatinib mesylate（STI571）[J].Blood，2003，102（6）：2236一2239.

[3] 邱志遠(yuǎn) ，范鈺 ，王崇強等.Cripto-1基因 siRNA對乳腺癌細(xì)胞侵襲力的影響[J].山東醫(yī)藥 ，2010，50（2）：27-29.

[4] GurzovEN.Izquierdo M .RNA interferenee against Hecl inhibits tumor growth invivo[J].GenehTer，2006，13（1）：1_7.

[5] Zhou W， Fu XQ， Liu J， Yu HG. RNAi knockdown of the Akt1 gene increases the chem osensitivity of gastric cancer cells to cisplatin both in vitro and invivo[J]. Regul Pept 2012； 176： 13-21.

[6] 鐘英強，黃花榮，付玉如等.siRNA 靶向沉默 hTERT 基因?qū)θ艘认侔┑牡蛲鲆种苹?bcl-2 和環(huán)氧合酶-2基因表達(dá)的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2010，4（8）：1221—1225.

[7] 金鵬， 謝晉良， 朱向榮等. shRNA介導(dǎo)GSTP1基因沉默對激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145的影響[J]. 中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版） 2012； 37：807-816.

[8] DengL，LiG ，XiL，et al.Hepatitis B virus inhibition in mice by lentivirla vector mediated short hairpin RNA[J].BMC Gastroenterol，2009 Oct 6； 9：73.

[9] 張敬群， 孫紅蕾， 馬業(yè)新，等. RNA干擾血管緊張素Ⅱ1a型受體對腎血管性高血壓大鼠血壓及心肌肥厚的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（16）：1-6.

[10] 李凡東，張海州，鄒承偉，等. 核糖核酸干擾抑制心肌細(xì)胞KCNJ2基因表達(dá)[J]. 中國循環(huán)雜志，2005，20（ 6） ： 468-471.

[11] Watanabe A，Arai M，Yamazaki M，et al. Phospholamban ablation by RNA interference increase Ca2 + up take into rat cardiac myocytesarcoplasmic reticulum[J]. J Mol Cell Cardiol，2004，37 （ 3 ） ：691-698.

[12] 楊廣，李小鷹，魯曉春. 利用 RNA 干擾技術(shù)治療慢性心衰大鼠的研究[J]. 中國分子心臟病學(xué)雜志，2007，7（ 2） ： 99-103.

[13] 劉明，趙鐵強，冼勛德，等. 應(yīng)用 RNA 干擾技術(shù)體外抑制脂蛋白脂肪酶基因的表達(dá)[J]. 中國動脈硬化雜志，2005，13（ 1） ：45-47.

[14] 洪濤，馮九庚，蔣麗萍，等. RNA 干擾抑制血管平滑肌細(xì)胞縫隙連接 Cx43 介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊[J]. 中華實驗外科雜志，2006，23（ 6） ： 768.