方勇

摘要：目的： 探討Zebularine對人肝癌細(xì)胞RASSFIA基因啟動(dòng)子甲基化以及mRNA表達(dá)的影響。方法： 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，分別用0.5、1.0、 2.0、5.0μmol/L的Zebularine與之孵育72h。甲基化特異性PCR檢測處理前后RASSFIA基因啟動(dòng)子甲基化水平。RT-PCR檢測RASSF1A mRNA表達(dá)。結(jié)果 ： 隨著藥物濃度的增加，甲基化RASSFIA含量逐漸降低。而非甲基化產(chǎn)物逐漸增高。此外，Zebularine處理后，RASSF1A mRNA的含量也隨之增高。結(jié)論： Zebularine可逆轉(zhuǎn)SMMC-7721細(xì)胞株細(xì)胞中基因甲基化修飾狀態(tài)。

關(guān)鍵詞： Zebularine；肝癌細(xì)胞；RASSFIA基因；啟動(dòng)子甲基化

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)衡陽聯(lián)合基金（No.12JJ9033）；湖南省科技廳項(xiàng)目（No.2013SK3118、2014SK3081）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)基金（No.10K052、12K094、13K083）；衡陽市科技局項(xiàng)目（No.2013KJ12、2013KJ28）

肝癌（liver cancer）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1， 2]。雖然手術(shù)療法是治療肝癌的主要方式，但對于已轉(zhuǎn)移至肝內(nèi)或者肝外的腫瘤，迄今為止尚無理想的治療方法[3， 4]。因此，尋求有效的的分子治療靶點(diǎn)，從源頭抑制肝癌的發(fā)生，是臨床工作者不懈的追求。近年來，DNA異常甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視[5， 6]。RAS相關(guān)區(qū)域家族1A 基因（RASSF1A） 是一種新型的抑癌基因，位于人體3號染色體短臂。RASSFlA不僅和細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)，同時(shí)也調(diào)控微管以及有絲分裂過程，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在多種腫瘤組織中，RASSF1A基因的表達(dá)降低或缺如[7]。這些研究結(jié)果表明RASSF1A是一種抑癌基因，RASSF1A的表達(dá)或者缺失可能是腫瘤發(fā)生的早期事件[8]。

Zebularine[1-（ B-D-呋喃核糖苷） -1，2-二氫嘧啶-2-酮]是一種新型的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（ DNA methyltransferase，DNMT） 抑制劑，可抑制后者甲基化作用從而對多種腫瘤具有抑制作用。本研究旨在觀察Zebularine對肝癌細(xì)胞RASSF1A基因表達(dá)的影響。

1.材料與方法

1.1 主要試劑

Zebularine購自Sigma。SMMC-7721細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保存中心?；蚪MDNA小量抽提試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。EZDNA甲基化試劑盒為北京天漠科技開發(fā)有限公司。Rnase Inhibitor、 dNTP，MULV酶購自TAKARA。人RASSFIA基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞接種于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁并且鋪滿瓶底面積的80%左右時(shí)，分別用0.5、 5.0、30、50.0μmol/L的Zebularine培養(yǎng)72h。

1.3 甲基化PCR

按照試劑盒提供的步驟獲取細(xì)胞基因組，隨后分別并對其進(jìn)行甲基化和亞硫酸氫鈉修飾處理。即，制備胞嘧啶-尿嘧啶轉(zhuǎn)換溶液，加入1μg DNA樣品后置于98℃ 10min，64℃ 2.5h后，4℃儲(chǔ)存6h。加入600μl結(jié)合緩沖液到離心柱中，離心洗脫DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。本文所用到的引物分別為：甲基化引物：5-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3， 5-GCTAACAAACGCGAACCG-3。非甲基化引物：5-GGTTTTGTGAGAGTGTGITAGG-3， 5-一CACTCAAACACAAACCAAAC-3。

1.4 RNA提取與RT-PCR

采用Trizol提取RNA，并根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行RT-PCR。RASSF1A的引物序列： 5′-TGG GAG ACA CCT GAC CTT TC-3′（上游）和5′-TGG GCA GGT AAA AGG AAG TG-3′（下游），擴(kuò)增產(chǎn)物長度為229bp。β-actin：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′（上游）和5-GTCCTrAATGTCACGCACGATTTC-3 （下游），擴(kuò)增產(chǎn)物410bp。逆轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa 公司試劑盒說明書進(jìn)行。PCR條件；95℃ 5min， 94℃ 30s，53℃ 40s， 72℃ 30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，并在圖像分析系統(tǒng)上進(jìn)行密度掃描，用RASSF1A基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度比值表示基因表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用one-way方差分析并行Students t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zebularine處理對RASSF1A甲基化的影響

甲基化PCR顯示，SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)0.5μmol/L Zebularine處理48h后，即可明顯降低甲基化RASSF1A的表達(dá)水平，且隨著Zebularine濃度的增加，甲基化RASSF1A逐漸降低，非甲基化產(chǎn)物逐漸升高，見表1。

2.2 Zebularine于不同時(shí)間影響細(xì)胞內(nèi)甲基化和非甲基化RASSF1A含量

SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)5.0 μmol/L Zebularine作用0～48h，MSP結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞中非甲基化RASSF1A基因表達(dá)水平較低，相對應(yīng)的，甲基化RASSF1水平逐漸增多（表2）。

2.3 Zebularine增加SMMC-7721細(xì)胞RASSF1A mRNA表達(dá)

SMMC-7721細(xì)胞中RASSF1A mRNA含量低下。而經(jīng)不同濃度Zebularine處理48h后，RT-PCR結(jié)果顯示RASSF1A mRNA水平隨之增高，其中5.0μmol/L Zebularine處理后RASSF1A mRNA增加了3.6倍。

2.4 Zebularine作用不同時(shí)間影響RASSF1A mRNA表達(dá)

采用5.0μmol/L Zebularine作用SMMC-7721細(xì)胞0～48h，RT-PCR檢測RASSF1A mRNA表達(dá)含量。結(jié)果顯示，Zebularine作用12h后RASSF1A mRNA增加了1.6倍，隨著時(shí)間的延長，RASSF1A mRNA表達(dá)量逐漸增高，48h后增加到3.4倍。

3 討論

RASSF1A是一種目前已經(jīng)得到公認(rèn)的抑癌基因，該基因的缺失、突變或低表達(dá)參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前已經(jīng)明確的機(jī)制主要包括調(diào)控細(xì)胞周期、降低有絲分裂、誘導(dǎo)調(diào)亡和抑制細(xì)胞增殖等。研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)低下，且在肝癌組織中，RASSF1A抑癌基因處于高甲基化狀態(tài)[9]。國內(nèi)學(xué)者江小杰等[10]在通過檢測肝癌組織中RASSF1A基因的表達(dá)水平后證實(shí)：在肝癌組織中，RASSF1A表達(dá)量明顯下調(diào)。而癌旁正常組織中RASSF1A mRNA水平是肝癌組織中的3倍以上。本研究中我們通過不同濃度的Zebularine處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，于不同的時(shí)間點(diǎn)檢測SMMC-7721細(xì)胞RASSF1A轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白的變化情況。結(jié)果顯示，Zebularine處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞株后， SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)RASSF1A mRNA表達(dá)顯著增高。同時(shí)，本研究也證實(shí)Zebularine也能以時(shí)間依賴性方式下調(diào)甲基化RASSF1A的水平及上調(diào)mRNA的表達(dá)。

RASSF1A基因失活機(jī)制很多，目前廣泛認(rèn)可的機(jī)制是由于RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生異常甲基化而造成的。趙強(qiáng)子[11]等使用甲基化抑制劑Zebularine處理RASSF1A表達(dá)異常的肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞后，可以觀察到RASSF1A的重新表達(dá)，提示甲基化抑制劑有望成為肝癌治療的新選擇。為了進(jìn)一步檢測肝癌SMMC-7721細(xì)胞RASSF1A基因甲基化狀態(tài)及Zebularine能否影響其甲基化水平。本研究采用甲基化特異性PCR（MSP）對其甲基化狀況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：空白組 RASSF1A 基因啟動(dòng)子區(qū)域可明顯擴(kuò)增出甲基化產(chǎn)物，而未甲基化RASSF1A表達(dá)水平很低。表明肝癌SMMC-7721 細(xì)胞 RASSF1A 基因呈甲基化狀態(tài)，經(jīng)Zebularine作用48h后，肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞 RASSF1A 基因啟動(dòng)子甲基化產(chǎn)物降低，而未甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物增高。說明紫Zebularine能有效逆轉(zhuǎn)肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞RASSF1A 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，打破基因表達(dá)沉默現(xiàn)象，并再次編碼翻譯蛋白，該蛋白能減少肝癌細(xì)胞增殖生長，這表明RASSHA基因存在高甲基化存在于肝癌細(xì)胞中，且高甲基化的修飾作用能減少RASSF1A抑癌基因的表達(dá)。此外，這種DNA甲基化狀態(tài)是可逆的，能被Zebularine去甲基化。

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