方勇 肖娟 劉重元 張志偉

摘要 ：目的：觀察LMP1羧基末端活性區(qū)3（CTAR3）在鼻咽癌干細胞遷移與侵襲中的作用。方法：首先建立LMP1和CTAR3缺失突變型LMP1（LMP1△252-351）的鼻咽癌干細胞SP18細胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351）；然后觀察LMP1和LMP1△252-351對SP18細胞遷移與侵襲的影響。結(jié)果：SP-LMP1△252-351細胞的遷移與侵襲能力較SP-LMP1細胞顯著降低（n=3，P<0.05）。結(jié)論：LMP1羧基末端CTAR3是其促鼻咽癌干細胞遷移與侵襲的重要功能活性區(qū)域。

關鍵詞：鼻咽癌干細胞；LMP1；遷移與侵襲

基金項目：湖南省自然科學衡陽聯(lián)合基金（No.12JJ9033）；湖南省科技廳項目（No.2013SK3118、2014SK3081）；湖南省高校創(chuàng)新平臺基金（No.10K052、12K094、13K083）；衡陽市科技局項目（No.2013KJ12、2013KJ28）

Abstract： Objective Observed the role of carboxy terminal activating region 3（CTAR3） of latent membrane protein 1（LMP1） in process of migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell. Methods The SP18 cell of stable expressed LMP1 and deletion mutant type LMP1 （LMP1△232-351） were established （SP18-LMP1and SP18-LMP1△252-351）. The effect of LMP1 and LMP1△232-351 for cellular migration and invasion were observed in SP18 cells. Results The migration and invasion of SP-LMP1△252-351 cells was obviously decreased to compare with SP-LMP1 cells （n=3， P<0.05）. Conclusion The LMP1-CTAR3 is important carboxy terminal activating region to promote migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell SP18 cell.

Keywords： nasopharyngeal carcinoma stem cell， LMP1， migration and invasion

潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein，LMP1）是EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）編碼的具有促細胞癌變和轉(zhuǎn)移作用的瘤蛋白[1]，該蛋白的羧基末端有三個功能活性區(qū)域（carboxyl terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3，它們是誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的重要功能活性位點[2]。腫瘤干細胞決定腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，被認為是腫瘤發(fā)生和復發(fā)的根源[3，4]。至今，LMP1 在鼻咽癌干細胞轉(zhuǎn)移中的作用仍不十分清楚。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 質(zhì)粒 逆病毒質(zhì)粒pLNSX-LMP1（含全長1.95kb野生型LMP1）和pLNSX-LMP1△232-351 （CTAR3缺失，含1.59kb的LMP1）由中南大學腫瘤研究所賀智敏教授惠贈[5，6]。

1.1.2 細胞 鼻咽癌干細胞SP18細胞株[7]由中山大學腫瘤防治中心惠贈，該細胞用含5%小牛血清（購自杭州四季青公司）的DMEM（Gibco BRL公司）培養(yǎng)。

1.1.3 試劑 Matrigel基質(zhì)膠（5mg/ml）為BD公司產(chǎn)品，Transwell小室（3428型）為Corning公司產(chǎn)品。單克隆抗體（一抗和二抗）購自Zymed Ltd，AMV Reverse Transcription 試劑盒購自Promega公司，G418和Liperfect2000脂質(zhì)體購自invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 建立穩(wěn)定表達LMP1和LMP1△232-351的SP18細胞 將SP18細胞種于6孔板中，分別用RV-LMP1和RV-LMP1△232-351逆病毒（加入8mg/L聚凝胺）37℃孵育SP18細胞2次（3～4 h/次，間隔8～12 h/次），然后400μg/ml G418篩選2周，匯合克隆擴大培養(yǎng)，建成穩(wěn)定表達LMP1和LMP1△232-351的轉(zhuǎn)染細胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351），用細胞免疫熒光檢測LMP1的表達。

1.2.2細胞免疫熒光實驗 制備細胞爬片，用甲醇與丙酮（1：1）固定、洗片、干燥后，用抗LMP1一抗（1：500）標記1 h（37℃），PBS洗片，用FITC標記的羊抗鼠二抗標計1 h（37℃），PBS洗滌，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3劃痕實驗 取數(shù)生長期細胞，以1×106個/孔細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)細胞至80%-90%融合度，用PBS洗洗細胞3次，加入新鮮無血清DMEM，用10μl TP頭比著直尺在6孔板中劃痕，用PBS洗細胞3次，加入無血清DMEM，37℃、5% CO2的培養(yǎng)。按0與24h測量與拍照，計算平均值并進行分析。

1.2.4 Transwell遷移和侵襲實驗 采用濾膜直徑6.5mm，濾膜孔徑8.0μm 的Transwell培養(yǎng)板。Transwell侵襲實驗過程，用無血清DMEM以1：5稀釋基質(zhì)膠，加入Transwell上室，37℃、5% CO2培養(yǎng)2 h。用無血清DMEM制備1×105個/ml單細胞懸液，加入200 μl于Transwell上室，下室加入500 μl 5%小牛血清DMEM，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦凈上室面基質(zhì)膠，下室用4%多聚甲醛固定15min，將小室倒置風干，結(jié)晶紫染色后，觀察和拍照，選取上、下、左、右和中5個視野計數(shù)細胞，然后計算平均數(shù)并進行分析。Transwell遷移實驗與Transwell侵襲實驗步驟一致，實驗時不加入基質(zhì)膠即可。

1.2.5統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗和χ2檢驗，數(shù)據(jù)以Mean+SD表示，以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 LMP1和LMP1△252-351蛋白的表達檢測

細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，LMP1和LMP1△252-351蛋白表達于SP18細胞漿和膜，建立了穩(wěn)定表達LMP1和LMP1△252-351的SP18細胞系，即SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351細胞（見圖1）。

SP18-LMP1 SP18-LMP1△232-351

圖1 細胞免疫熒光檢測LMP1和LMP1△252-351蛋白的表達

2.2細胞劃痕實驗觀察LMP1和LMP1△232-351對SP18細胞遷移的影響

細胞劃痕（圖2和表1）結(jié)果顯示，SP18-LMP1△232-351細胞的遷移率較SP18-LMP1細胞低（n=3，P<0.05），說明SP18-LMP1△232-351細胞的遷移能力較SP18-LMP1細胞低，提示LMP1可促進SP細胞的遷移，CTAR3是LMP1促進細胞遷移的重要活動區(qū)域。

圖2 細胞劃痕實驗檢測LMP1△232-351對SP18細胞遷移

A1： SP18-LMP1細胞在0h情況； A2： SP18-LMP1細胞在24h情況；

B1： SP18-LMP1△232-351細胞在0h情況； B2： SP18-LMP1△232-351細胞在24h情況。

表1 劃痕實驗檢測SP18-LMP1和 SP18-LMP1△232-351細胞遷移情況

2.3 Transwell遷移與侵襲實驗檢測LMP1和LMP1△232-351對SP18細胞的影響

Transwell遷移與侵襲實驗結(jié)果（圖3和表2）顯示，SP18-LMP1△232-351細胞的遷移與侵襲細胞數(shù)較SP18-LMP1細胞少（n=3，P<0.05），說明SP18-LMP1△232-351細胞的遷移與侵襲能力較SP18-LMP1細胞低，同樣提示LMP1可促進SP細胞的遷移與侵襲， CTAR3是LMP1促進細胞遷移與侵襲的重要活動區(qū)域。

圖3 Transwell遷移和侵襲實驗檢測LMP1△232-351對SP18細胞遷移與侵襲的影響

A： SP18-LMP1細胞遷移情況； B： SP18-LMP1△232-351細胞的遷移情況；

C： SP18-LMP1細胞的侵襲情況； D： SP18-LMP1△232-351細胞的侵襲情況。

表2 Transwell遷移和侵襲實驗檢測SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351細胞遷移與侵襲情況

3 討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學特征之一，LMP1是目前EB病毒編碼少數(shù)幾個被確認與腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關的致瘤蛋白。LMP1羧基末端第三個活性區(qū)域由Gires等[7]1999年首次提出，其在淋巴細胞中與細胞的增殖密切相關。LMP1-CTAR3可以激活JAK3/STAT信號通路，促進鼻咽上皮細胞的增殖[8]。Bentz GL等最新研究表明[9]，羧基末端活化區(qū)域3通過與UBC9之間相互作用可促進LMP1介導的細胞遷移，提示CTAR3在LMP1對腫瘤遷移侵襲的影響及其機制中可能發(fā)揮重要作用。

腫瘤干細胞假說是近年來提出的關于腫瘤轉(zhuǎn)移新理論，是指腫瘤干細胞具有較強的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，腫瘤干細胞的存在是腫瘤轉(zhuǎn)移的原因。鼻咽癌干細胞SP18細胞系是2007年中山大學腫瘤防治中心曾益新等建立的一類具有干細胞特性的鼻咽癌干細胞[10]，鼻咽癌干細胞在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。

我們以往的研究證實，CTAR3是LMP1發(fā)揮生物學作用的主要區(qū)域，其可以激活JAK3/STAT信號通路，促進鼻咽上皮細胞的增殖[11]。本研究結(jié)果顯示，LMP1能促進鼻咽癌干細胞SP18的遷移及侵襲，CTAR3缺失后LMP1促進遷移及侵襲能力明顯降低，提示CTAR3是LMP1促進鼻咽癌干細胞SP18遷移及侵襲的重要活性區(qū)域，至于CTAR3通過何種信號途徑發(fā)揮其促進鼻咽癌干細胞SP18遷移及侵襲，仍有待深入研究。

參考文獻：

1.Zhang Q， Zhang Z W， Wang C K， et al. Proteome analysis of the transformation potential of the Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 in nasopharyngeal epithelial cells NP69[J]. Mol Cell Biochem， 2008， 314（1～2）： 73-83.

2.Lavorgna A， Harhaj E W. EBV LMP1： New and shared pathways to NF-κB activation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012，109（7）：2188-2189.

3.Wang W J， Wu S P， Liu J B， et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Cancer Res. 2013，73（3）：1219-1231.

4.Wu M S， Wang G F， Zhao Z Q， et al.Smac mimetics in combination with TRAIL selectively target cancer stem cells in nasopharyngeal carcinoma[J]. Mol Cancer Ther. 2013，12（9）： 17281737.

5.張志偉， 張 瓊， 余艷輝等. Epstein-Barr 病毒潛伏性膜蛋白1 CTAR3 缺失突變體的構(gòu)建與功能分析[J]. 微生物學報， 2008， 48 （10）：1308-1313.

6.張志偉， 張 瓊， 余艷輝等. EB病毒LMP1-CTAR3對NP69細胞增殖和蛋白表達的影響[J]. 生物化學與生物物理學進展， 2009， 36（5）： 580-586.

7.GiresO， KohlhuberF， Kilger E， et al. Latent membrane protein 1 of Epstein Barr virus interacts with JAK3 and activates STAT proteins [J]. EMBO J， 1999， 18： 3064-3073.

8.Lin Q， LaiR， Chirieac LR， et al. Constitutive activation of JAK3/STAT3 in colon carcinoma tumors and cell lines： inhibition of JAK3/STAT3 signaling induces apoptosis and cell cycle arrest of colon carcinoma cells [J]. Am J Patho，l 2005， 167（4）： 969-80.

9.Bentz GL， Whitehurst CB， Pagano JS. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 （LMP1） C-terminal-activating region 3 contributes to LMP1-mediated cellular migration via its interaction with Ubc9 [J]. J Virol. 2011， 85（19）：10144-53.

10.Wang J，Guo LP，Chen LZ，et al.Identification of cancer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J]. Cancer Res.2007；67（8）：3716-3724.

11.全勝，莊英幟，張志偉等. LMP1-CTAR3對鼻咽癌干細胞SP18生長的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（45）：8395- 8398.