胡蘭 余敏君 胡新年 江濤 劉莎 王建平

摘要：目的：觀察西格列汀誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟表達(dá)血紅素氧合酶-1（HO-1）表達(dá)的影響。方法 ： 選取SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，隨后模型組大鼠采STZ（30mg/kg）腹腔注射以建立糖尿病腎病大鼠模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）、低劑量[1mg/（kg·d），n=10]和高劑量[10mg/（kg·d），n=10]西格列汀干預(yù)組，10周后，獲取大鼠腎組織，Western blot檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)，比色法分析HO-1酶活性。結(jié)果：與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠中HO-1蛋白表達(dá)水平、mRNA水平以及HO-1酶活性有輕度增高。而采用不同濃度的西格列汀干預(yù)后HO-1蛋白表達(dá)水平、mRNA水平以及HO-1酶活性進(jìn)一步增加，并呈一定的劑量依賴性。結(jié)論：西格列汀能上調(diào)糖尿病大鼠腎臟表達(dá)HO-1。

關(guān)鍵詞： 西格列??；紅素氧合酶-1；糖尿病

糖尿病腎病是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要原因。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前大量的證據(jù)表明糖尿病引起的氧化應(yīng)激與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。生理?xiàng)l件下，機(jī)體在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（ROS）損害時(shí)形成了一套復(fù)雜的抗氧化應(yīng)激應(yīng)答防御系統(tǒng)，即當(dāng)暴露于ROS時(shí)，機(jī)體自身能通過誘導(dǎo)表達(dá)一系列保護(hù)性蛋白，來緩解組織細(xì)胞遭受的損害。血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）-1是血紅素降解的起始酶以及限速酶，是一種具有拮抗氧化應(yīng)激作用的抗氧化酶，是細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的一個(gè)敏感指標(biāo)。在生理狀態(tài)下，腎臟中僅腎髓質(zhì)低水平表達(dá)HO-1，但在糖尿病等病理狀態(tài)下，HO-1受誘導(dǎo)表達(dá)水平增高，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎癥的效應(yīng)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)西格列汀具有潛在的大血管保護(hù)作用，為糖尿病大血管病變的防治開辟了新的治療途徑。研究顯示西格列汀可通過激活環(huán)磷酸腺苷途徑減少AGE的形成，抑制NF-κB的激活，以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，來發(fā)揮血管保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病腎病大鼠模型，觀察西格列汀對(duì)HO-1表達(dá)的有何影響，從而探討其對(duì)血管保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRIZol 購(gòu)自Invitrogen 公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從Fermentas公司購(gòu)買；血紅素氧合酶-1活性試劑盒上海GENMED公司；RIPA裂解液、ECL試劑盒購(gòu)自Thermo；鼠抗人HO-1購(gòu)自Cell Signaling。

1.2 模型的建立

65只健康清潔級(jí)雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，3月齡，體重180-220g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)前于一般飼料條件下喂養(yǎng)大鼠l周以適應(yīng)環(huán)境，測(cè)量大鼠血糖保證其在正常的范圍內(nèi)。隨機(jī)選取15只大鼠作為正常對(duì)照組（NC組），給予NC組普通飼料喂養(yǎng)直到研究結(jié)束。剩下的50只大鼠用作糖尿病造模組，給予高糖高脂的飼料（普通飼料加入10%熟豬油、10%蔗糖、0.2%膽酸鈉、2%膽固醇）共4周（每日熱量不限）。在造模組和正常組中各隨機(jī)取出15只大鼠，稱重后將其禁食12h，于大鼠的右眼眶后靜脈叢進(jìn)行取血，取1.5～2ml置于4℃的條件下進(jìn)行自然凝聚。隨后以3000rpm離心5min，移取上清液進(jìn)行空腹胰島素和空腹血糖檢測(cè)，計(jì)算出胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），確認(rèn)造模組的大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗以后，對(duì)其進(jìn)行禁食，12h后通過腹腔內(nèi)注射給予鏈脲佐菌素（STZ），劑量是30mg/kg，在冰浴下用0.1mmol/L的無菌的枸櫞酸鈉緩沖液配制1%STZ溶液，并將其調(diào)為PH4.4，于4℃條件下保存，注意要現(xiàn)用現(xiàn)配。為正常組大鼠腹腔注射對(duì)應(yīng)體積的無菌枸櫞酸鈉緩沖液。72h后對(duì)大鼠行尾靜脈取血以檢測(cè)血糖，若血糖濃度不足16.7mmol/L，再次對(duì)其腹腔內(nèi)注射STZ，20mg/kg。若大鼠不同日的三次隨機(jī)血糖濃度不低于16.7mmol/L，將其選為糖尿病模型。進(jìn)行眶內(nèi)靜脈取血操作時(shí)，有2只造模組大鼠由于麻醉及取血操作的問題死亡，還有1只大鼠造模失敗，最后共有47只大鼠糖尿病造模成功。

1.3 HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè)

模型建立10周后處死大鼠，獲取腎臟組織并制成勻漿，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液充分裂解組織，4℃ 12，000 rpm離心10 min，獲取上清用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞總蛋白的提取試劑盒嚴(yán)格按照說明書使用。將前面提取出的蛋白進(jìn)行蛋白定量以后，取等量蛋白裂解液于10%-12%的SDS-PAGE上進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，然后置于5%無脂奶粉中，進(jìn)行封閉1h，再加入適當(dāng)稀釋比例的一抗于4℃條件下孵育過夜，加適量稀釋的二抗于37℃條件下孵育1h，用ECL試劑進(jìn)行顯影。

1.4 HO-1 mRNA表達(dá)分析

用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并取3μg的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物信息如下：HO-1上游引物：5- CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC -3′，HO-1下游引物： 5′- AGACGCTTTACGTAGTGCTG -3′； β-actin上游引物： 5′- CCTGTATGCCTCTGGTCGTA -3′， β-actin下游引物： 5′- CCATCTCTTGCTCGAAGTCT -3′，將獲得的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行Realtime-PCR。定量PCR擴(kuò)增程序如下：50℃ 2 min，隨后進(jìn)入95℃10 min，最后進(jìn)行95℃ 15 s，58℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)，結(jié)果以相對(duì)表達(dá)量表示。

1.5 HO-1酶活性分析

將獲取的組織上清至1.5 mL的EP管中（可分多次收集），1，000 rpm離心8 min，棄上清，加1.5 mL的GENMED清理液A去清洗細(xì)胞，1，000 rpm離心8 min，棄上清，瀝干，將EP管放置冰上，加入100 μL GENMED裂解液B，充分混勻，超聲裂解細(xì)胞，（超聲條件：振幅14 nm，10 s，間隔15 s，重復(fù)3～5次）。最后將裂解液置于4℃，10，000 rpm離心15 min，吸取上清放置另一新的EP管中，按照試劑盒提供的操作步驟，計(jì)算出血紅素氧合酶-1的活性，結(jié)果以相對(duì)活性表示（模型組活性/對(duì)照組活性×100%）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用±SD表示，并采用One-Way ANOVA方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 西格列汀對(duì)HO-1蛋白表達(dá)的影響

西格列汀對(duì)HO-1蛋白表達(dá)的影響見表1。

表1 西格列汀對(duì)HO-1蛋白表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠中HO-1蛋白表達(dá)水平有一定提高。用高劑量西格列汀干預(yù)后，HO-1蛋白表達(dá)水平比低劑量西格列汀干預(yù)組進(jìn)一步增加，呈一定的劑量依賴性。

2.2 西格列汀對(duì)HO-1 mRNA表達(dá)的影響

西格列汀對(duì)HO-1 mRNA表達(dá)的影響見表2。

表2 西格列汀對(duì)HO-1 mRNA表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠中HO-1 mRNA表達(dá)水平有一定提高。用高劑量西格列汀干預(yù)后，HO-1 mRNA表達(dá)水平比低劑量西格列汀干預(yù)組進(jìn)一步增加，呈一定的劑量依賴性。

2.3西格列汀對(duì)HO-1酶活性的影響

西格列汀對(duì)HO-1酶活性的影響見表2。

表2 西格列汀對(duì)HO-1酶活性的影響

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠中HO-1酶活性有一定提高。用高劑量西格列汀干預(yù)后，HO-1酶活性比低劑量西格列汀干預(yù)組進(jìn)一步增加，呈一定的劑量依賴性。

3討論

糖尿病是一種常見的代謝疾病群，糖尿病的并發(fā)癥有100多種，是目前已知疾病當(dāng)中并發(fā)癥最多的，糖尿病腎病是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要原因[1]。胰島素作用缺陷或（和）胰島素分泌缺陷導(dǎo)致高血糖。高血糖和繼發(fā)的脂代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species ，ROS）增多，同時(shí)機(jī)體清除活性氧簇系統(tǒng)的功能降低，氧化級(jí)抗氧化功能間失衡[2]。生理?xiàng)l件下，機(jī)體在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（ROS）損害時(shí)形成了一套復(fù)雜的抗氧化應(yīng)激應(yīng)答防御系統(tǒng)，即當(dāng)暴露于ROS時(shí)，機(jī)體自身能通過誘導(dǎo)表達(dá)一系列保護(hù)性蛋白，來緩解組織細(xì)胞遭受的損害[3]。目前，拮抗氧化應(yīng)激在糖尿病慢性并發(fā)癥的防治方面具有重大意義。

血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）-1是血紅素降解的起始酶以及限速酶，是細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的一個(gè)敏感指標(biāo)[4]。在生理狀態(tài)下，腎臟中僅腎髓質(zhì)低水平表達(dá)HO-1，但在糖尿病等病理狀態(tài)下，HO-1受誘導(dǎo)表達(dá)水平增高，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎癥的效應(yīng)[5]。糖尿病患者的腎組織中產(chǎn)生的ROS過多，HO-1受到較強(qiáng)的誘導(dǎo)[6]。本研究利用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病腎病大鼠模型。糖尿病動(dòng)物模型包括人工誘發(fā)以及遺傳自發(fā)兩類，人工誘發(fā)是指為四氧嘧啶（alloxan）或大鼠注射鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）等藥物誘導(dǎo)其產(chǎn)生糖尿病[7]。STZ對(duì)動(dòng)物胰島B細(xì)胞的損害存在較高的特異性，故廣泛應(yīng)用于糖尿病動(dòng)物模型的復(fù)制。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)西格列汀具有潛在的大血管保護(hù)作用，為糖尿病大血管病變的防治開辟了新的治療途徑，西格列汀可通過激活環(huán)磷酸腺苷途徑減少AGE的形成，抑制NF-κB的激活，以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，來發(fā)揮血管保護(hù)作用[8]。本研究以糖尿病腎病大鼠模型為研究對(duì)象，觀察西格列汀對(duì)HO-1表達(dá)的有何影響。結(jié)果表明：與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠中HO-1蛋白表達(dá)水平、mRNA水平以及HO-1酶活性有輕度增高。而采用不同濃度的西格列汀干預(yù)后HO-1蛋白表達(dá)水平、mRNA水平以及HO-1酶活性進(jìn)一步增加，并呈一定的劑量依賴性。有研究表明，HO-1上調(diào)可以使得胰島素抵抗改善，血清脂聯(lián)素的水平提高，胰島素敏感性增強(qiáng)，肝臟 MDA 水平減少，HO-1上調(diào)具有抗糖尿病的功效[9]。HO-1可以有效抗氧化，它能夠增強(qiáng)過氧化氫酶以及細(xì)胞外超氧化物歧化酶的活性，降低上皮細(xì)胞的凋亡，減少超氧陰離子形成[10]。

綜上所述，西格列汀能上調(diào)糖尿病大鼠腎臟表達(dá)HO-1，對(duì)糖尿病的治療具有一定意義。

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