王立豐　王紀(jì)坤　安鋒　謝貴水

摘 要 細(xì)胞色素b561通過(guò)參與抗壞血酸的再生在活性氧淬滅、生長(zhǎng)發(fā)育和抗旱等生理過(guò)程中起作用。從巴西橡膠樹熱研7-33-97葉片中克隆一個(gè)細(xì)胞色素b561基因，其推導(dǎo)氨基酸含有特征性Cyt_b561家族結(jié)構(gòu)域，命名為HbCytb561。該基因在花、葉片和膠乳中表達(dá)，在樹皮中不表達(dá)。干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染均顯著上調(diào)該基因在橡膠樹葉片中表達(dá)。結(jié)果說(shuō)明HbCytb561基因受逆境反應(yīng)誘導(dǎo)，參與橡膠樹抗逆響應(yīng)的生理和分子機(jī)制。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；干旱；細(xì)胞色素b561；活性氧；機(jī)械傷害

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Cytochrome b561 takes part in reactive oxygen species scavenges， growth and development as well as drought tolerance through regeneration of ascorbic acid. In this study， a HbCytb561 was cloned and designated from the leaves of rubber tree clone CATAS7-33-97， which containing specific Cyt_b561 superfamily domain. The highest expression was observed in flowers， then in leaves and latex. No expression was found in the bark. Drought， mechanical wounding and powdery mildew infection up regulated its expression at significant level. These suggested that HbCytb561， inducted by stress environment， play roles in physiological and molecular mechanisms of stress resistance in rubber tree.

Key words Hevea brasiliensis； Drought； Cytb561； ROS； Mechanical wounding

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.008

細(xì)胞色素b561（Cytochrome b561）家族含有b561核心結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其特征基序的不同，將其分為7個(gè)亞家族，其中B組為植物家族[1]。細(xì)胞色素b561是含有2個(gè)血紅素分子的內(nèi)膜蛋白，參與抗壞血酸（維生素C）再生[2]。其作用機(jī)制是作為電子傳遞體攜帶電子跨過(guò)質(zhì)膜，將電子從抗壞血酸分子轉(zhuǎn)移到受體分子上?？箟难釂坞娮友趸漠a(chǎn)物-單脫氫抗壞血酸（MDHA）在哺乳動(dòng)物和植物中被鑒定為是細(xì)胞色素b561的電子受體。細(xì)胞色素b561催化MDHA還原導(dǎo)致還原性抗壞血酸的再生。細(xì)胞色素b561在人類[3]、動(dòng)物[4]和植物中都有發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)物種含有3～4個(gè)細(xì)胞色素b561同源蛋白，是疏水性蛋白，含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（TMH1～TMH6）。TMH2～TMH5這4個(gè)跨膜螺旋是最保守區(qū)域，TMH1和TMH6則保守型相對(duì)較差。在植物擬南芥、葡萄、大豆和玉米等植物中發(fā)現(xiàn)了Cytb561基因家族成員[5]，證明其參與擬南芥抗病[6]、西瓜抗旱[7]等生理過(guò)程，其功能受到膜電勢(shì)[8]、小RNA[9]和二氫硫辛酸[10]等調(diào)節(jié)。

中國(guó)橡膠樹種植經(jīng)常面對(duì)寒害[11]、風(fēng)害和干旱[12]等逆境的威脅。目前，發(fā)現(xiàn)橡膠樹寒害和干旱逆境響應(yīng)均與活性氧代謝和淬滅有關(guān)[13]。活性氧淬滅可分為酶促和非酶促2個(gè)類型，主要與SOD、抗壞血酸、酚類等相關(guān)[14]。例如，干旱可導(dǎo)致巴西橡膠樹病蟲害發(fā)生率[15]、死皮率增加，還增加災(zāi)害預(yù)報(bào)和管理成本[16-17]， 降低膠乳產(chǎn)量[18]。已有研究結(jié)果證明，干旱會(huì)誘導(dǎo)橡膠樹滲透調(diào)節(jié)能力變化[19]，也會(huì)導(dǎo)致葉片中蛋白質(zhì)含量變化[20]。筆者發(fā)現(xiàn)干旱會(huì)誘導(dǎo)抗壞血酸過(guò)氧化物酶的上調(diào)表達(dá)[13]，因此推測(cè)抗壞血酸再生與橡膠樹抗旱性緊密相關(guān)。筆者擬從巴西橡膠樹熱研7-33-97葉片中克隆與抗壞血酸再生密切相關(guān)的HbCytb561基因，研究其在逆境條件下的表達(dá)規(guī)律，為闡明HbCytb561基因在橡膠逆境響應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以位于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)二隊(duì)15年生巴西橡膠樹品種熱研7-33-97開(kāi)割樹為材料，采集葉片、膠乳、花和樹皮用于組織表達(dá)分析[21]。以中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)五隊(duì)培育的熱研7-33-97芽接苗為材料，選取均勻一致的2蓬葉且頂篷葉片處于穩(wěn)定期的芽接苗進(jìn)行干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染處理。

1.2 方法

1.2.1 植物材料RNA提取和cDNA合成 膠乳、葉片等材料總RNA提取根據(jù)Qin等[21]的方法，利用DNaseⅠ去除RNA中殘留的少量DNA。所提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD230、OD260、OD280吸收值以檢測(cè)純度，同時(shí)采用1%甲醛變性膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。cDNA第Ⅰ鏈合成參照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit， Fermentas試劑盒說(shuō)明書[22]。

1.2.2 HbCytb561基因的克隆 根據(jù)GenBank公布的人類、擬南芥和蓖麻等細(xì)胞色素b561蛋白序列，在橡膠樹EST數(shù)據(jù)庫(kù)中做TBLASTN搜索，通過(guò)DNAman軟件拼接同源片段，得到巴西橡膠樹細(xì)胞色素b561基因的cDNA序列。采用primer 6.0軟件設(shè)計(jì)基因特異引物Cytb561F1（5′-CTCACAGG

CTCACACTTAA-3′）和cytb561R1（5′-TCAGTTGAAG

TCATAGGACG-3′），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第Ⅰ鏈為模板，擴(kuò)增巴西橡膠樹細(xì)胞色素b561基因的cDNA序列。使用2×Taq PCR MasterMix（天根生化）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s；55 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，凝膠回收純化，并克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，送上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證[23]。

1.2.3 HbCytb561的生物信息學(xué)分析 采用NCBI ORF Finder 在線分析工具預(yù)測(cè)基因的ORF及其編碼的氨基酸序列，通過(guò)Expasy的ProtParam在線分析軟件分析巴西橡膠樹細(xì)胞色素b561蛋白中各種氨基酸含量，并預(yù)測(cè)得到理論分子量和等電點(diǎn)；用NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫(kù)和SMART在線分析軟件分析蛋白的結(jié)構(gòu)；用SignalP 4.1 Server在線分析軟件分析信號(hào)肽結(jié)構(gòu)；用TMHMM 2.0 Server在線分析軟件分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)blastp搜索其它物種的細(xì)胞色素b561同源蛋白并獲取其序列，利用DNAman8.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)[23]。

1.2.4 HbCytb561基因表達(dá)分析 干旱處理采用先將芽接苗澆水至飽和，然后放在光照培養(yǎng)箱進(jìn)行斷水處理，連續(xù)采集0～10 d葉片為材料[13]；機(jī)械傷害處理采用Qin等[21]的方法；白粉菌處理采用筆者發(fā)表的方法[24]。以熒光定量引物N561F（5′-CTAC

AGTTAGGAGCGAGTC-3′）和N561R（5′-ACAGCAG

TGAAGTTGATGA-3′）擴(kuò)增，以HbACTIN為內(nèi)參基因，分析HbCytb561的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件（版本號(hào)21）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)分析不同處理間基因表達(dá)的差異顯著性。采用Origin2015科技繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbCytb561基因克隆與生物信息學(xué)分析

HbCytb561（基因登錄號(hào)：KM086717）基因，全長(zhǎng)977 bp，其5′端長(zhǎng)度為228 bp，3′端長(zhǎng)度為50 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為702 bp，編碼233個(gè)氨基酸（圖1）。其推導(dǎo)氨基酸分子量為25.3 ku，等電點(diǎn)8.61，分子式為C1 211H1 876N282O298S5，為疏水性蛋白。推導(dǎo)氨基酸與蓖麻RcCytb561（Ricinus communis，XP_002510795.1）、花煙草NsTAF1L（Nicotiana sylvestris，XP_009778201.1）、煙草NtTAF1L（Nicotiana tomentosiformis，XP_009590952.1）和苜蓿MtCytb（Medicago truncatula，XP_003638360.1）相似性分別為77%、68%、67%和69%，是細(xì)胞色素b561家族成員。第80位賴氨酸和第105位組氨酸是底物識(shí)別位點(diǎn)（圖2）。

生物信息學(xué)分析可以看出（圖3），HbCytb561基因推導(dǎo)的氨基酸序列中1～37位氨基酸編碼信號(hào)肽，49～175位氨基酸編碼特異的Cyt_b561 superfamily結(jié)構(gòu)域（圖3-A）。亞細(xì)胞定位分析表明，其在質(zhì)膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔的幾率分別為0.64、0.46、037和0.10，表明細(xì)胞色素b561定位在質(zhì)膜上（圖3-B）。根據(jù)跨膜軟件分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素b561蛋白在10～32、45～67、82～104、116～138、

153～175和195～217具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3-C）。

2.2 HbCytb561基因的表達(dá)分析

干旱處理橡膠樹芽接苗10 d葉片中，HbCytb561在第3天有顯著上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，隨后隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸下降，在第8天又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后下降（圖4）。這說(shuō)明，細(xì)胞色素b561參與橡膠樹干旱響應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)期為第3天。

從圖5的組織表達(dá)分析可以看出，HbCytb561在花中的表達(dá)量最高，在葉片和膠乳中表達(dá)量次之，在樹皮中不表達(dá)。說(shuō)明其主要在花、葉片和膠乳中起作用。

從圖6可以看出，機(jī)械傷害處理葉片后，在1～2 h上調(diào)HbCytb561的表達(dá)，隨后下降，其表達(dá)最高峰出現(xiàn)在在機(jī)械傷害處理后的10～24 h，說(shuō)明HbCytb561參與橡膠樹對(duì)機(jī)械傷害的早期反應(yīng)。

白粉菌侵染后不同級(jí)別的葉片中HbCytb561的表達(dá)顯著上調(diào)，尤其在3級(jí)和4級(jí)葉片中上調(diào)分別為4.5和3倍。說(shuō)明白粉菌侵染會(huì)導(dǎo)致HbCytb561表達(dá)的顯著增加，與干旱和機(jī)械傷害的結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 HbCytb561是植物細(xì)胞色素b561家族成員

抗壞血酸在真核生物中參與多種基礎(chǔ)的代謝反應(yīng)，細(xì)胞色素b561是抗壞血酸依賴的氧化還原酶，具有高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)，在抗壞血酸循環(huán)和離子吸收起到重要作用[6]。目前，其結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展迅速[25]。筆者從橡膠樹品種熱研7-33-97葉片中克隆了HbCytb561基因，與蓖麻、煙草中的細(xì)胞色素b561基因相似度達(dá)70%以上，含有特征性Cytb561結(jié)構(gòu)域，并含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。物種間差異會(huì)引起細(xì)胞色素b561基因結(jié)構(gòu)和定位的差異。例如，亞細(xì)胞定位已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素b561基因定位在溶酶體[26]和液泡膜上[27]，而筆者發(fā)現(xiàn)HbCytb561定位在質(zhì)膜上。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)賴氨酸81和組氨酸106對(duì)于底物識(shí)別和催化具有重要作用[28]，在玉米中發(fā)現(xiàn)精氨酸72和酪氨酸71是保守位點(diǎn)[29]。HbCytb561由于物種差異，其底物結(jié)合位點(diǎn)與擬南芥相差一位。上述分析說(shuō)明HbCytb561是植物細(xì)胞色素b561家族成員。

3.2 HbCytb561參與橡膠樹干旱等抗逆反應(yīng)

盡管植物中對(duì)細(xì)胞色素b561基因結(jié)構(gòu)研究較多，但對(duì)其生理功能研究較少。已經(jīng)證明，細(xì)胞色素b561具有促進(jìn)抗壞血酸再生[30]、生長(zhǎng)發(fā)育[31]和參與抗旱[7]的作用。橡膠樹生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常遇到干旱、白粉菌侵染等脅迫，同時(shí)割膠亦會(huì)導(dǎo)致對(duì)橡膠樹樹皮的傷害。筆者發(fā)現(xiàn)，干旱會(huì)誘導(dǎo)橡膠樹葉片產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧淬滅酶基因表達(dá)和活性增加。干旱處理3～5 d是橡膠樹生理反應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)期。本文中，HbCytb561基因受干旱上調(diào)表達(dá)，其在第3天表達(dá)豐度最高，說(shuō)明同其它活性氧淬滅酶一起參與了橡膠樹抗旱生理反應(yīng)。隨后，由于干旱的加重，導(dǎo)致其基因表達(dá)持續(xù)下降。在西瓜中證明上調(diào)表達(dá)細(xì)胞色素b561和抗壞血酸氧化酶基因能提高野生西瓜對(duì)干旱和高光照的抗性[7]。機(jī)械傷害和白粉菌侵染會(huì)導(dǎo)致葉片中活性氧含量上升，進(jìn)而導(dǎo)致HbCytb561基因上調(diào)表達(dá)。筆者證明了在橡膠樹葉片中HbCytb561參與抗逆調(diào)控，是對(duì)細(xì)胞色素b561基因生物功能的深入詮釋。

本研究結(jié)果說(shuō)明HbCytb561含有細(xì)胞色素b561家族特征的結(jié)構(gòu)域，參與橡膠樹對(duì)干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染的響應(yīng)，將為闡明細(xì)胞色素家族成員功能和篩選橡膠樹抗逆診斷指標(biāo)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Tsubaki M， Takeuchi F， Nakanishi N. Cytochrome b561 protein family： expanding roles and versatile transmembrane electron transfer abilities as predicted by a new classification system and protein sequence motif analyses[J]. Biochim Biophys Acta， 2005， 1 753（2）： 174-190.

[2] Lane D J， Bae D H， Merlot A M， et al. Duodenal cytochrome b（DCYTB）in iron metabolism： an update on function and regulation[J]. Nutrients， 2015， 7（4）： 2 274-2 296.

[3] Zhang K， Deacon D C， Rao F， et al. Human heart rate： heritability of resting and stress values in twin pairs， and influence of genetic variation in the adrenergic pathway at a microribonucleic acid microRNA motif in the 3′-UTR of cytochrome b561[J]. J Am Coll Cardiol， 2014， 63（4）： 358-368.

[4] Srivastava M， Pollard H B， Fleming P J. Mouse cytochrome b561： cDNA cloning and expression in rat brain， mouse embryos， and human glioma cell lines[J]. DNA Cell Biol， 1998， 17（9）： 771-777.

[5] Opiyo S O， Moriyama E N. Mining Cytochrome b561 proteins from plant genomes[J]. Int J Bioinform Res Appl， 2010， 6（2）： 209-221.

[6] Costa A， Barbaro R， Sicilia F， et al. AIR12， a b-type cytochrome of the plasma membrane of Arabidopsis thaliana is a negative regulator of resistance against Botrytis cinerea[J]. Plant Science， 2015， 233： 32-43.

[7] Nanasato Y， Akashi K， Yokota A. Co-expression of cytochrome b561 and ascorbate oxidase in leaves of wild watermelon under drought and high light conditions[J]. Plant Cell Physiol， 2005， 46（9）： 1 515-1 524.

[8] Picco C， Scholz-Starke J， Naso A， et al. How are cytochrome b561 electron currents controlled by membrane voltage and substrate availability？[J]. Antioxid Redox Signal， 2014， 00（00）： 1-8.

[9] Huang H， Zhang K， Zhou Y， et al. MicroRNA-155 targets cyb561d2 in zebrafish in response to fipronil exposure[J]. Environ Toxicol， 2014. DOI： 10.1002/tox.22099.

[10] Berczi A， Zimanyi L， Asard H. Dihydrolipoic acid reduces cytochrome b561 proteins[J]. Eur Biophys J， 2013， 42（2-3）： 159-168.

[11] 王立豐， 吳紹華， 田維敏. 巴西橡膠樹抗寒機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012， 37（7）： 1 320-1 325.

[12] 王立豐， 王紀(jì)坤， 謝貴水. 巴西橡膠樹抗旱機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（2）： 426-431.

[13] Wang L F. Physiological and molecular responses to drought stress in rubber tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）[J]. Plant Physiol Biochem， 2014， 83： 243-249.

[14] 王立豐， 陸艷茜， 鄧玉杰. 光照強(qiáng)度對(duì)巴西橡膠樹淡綠期葉片光合特性和活性氧代謝的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（6）： 1 131-1 136.

[15] 郭金斌. 干旱要加強(qiáng)防治橡膠樹蟲害[J]. 農(nóng)藥市場(chǎng)信息， 2012（10）： 47.

[16] 溫福光. 物候因子干旱災(zāi)害長(zhǎng)期預(yù)報(bào)[J]. 災(zāi)害學(xué)， 1991， 6（1）： 89-94.

[17] 李新梅. 干旱期橡膠樹的管理[J]. 致富天地， 2010（05）： 31.

[18] 鄧光輝， 黃學(xué)全. 淺析海南墾區(qū)干旱地區(qū)采膠方法及思路[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)， 2014（04）： 15-19.

[19] 宮麗丹， 田耀華， 龍?jiān)品澹?等. 持續(xù)干旱脅迫及復(fù)水對(duì)橡膠樹滲透調(diào)節(jié)能力的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（01）： 35-38.

[20] 林秀琴， 袁 坤， 王真輝， 等. 干旱脅迫下橡膠樹葉片差異表達(dá)蛋白的鑒定與功能解析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（12）： 1 782-1 788.

[21] Qin B， Zheng F， Zhang Y. Molecular cloning and characterization of a Mlo gene in rubber tree（Hevea brasiliensis）[J]. J Plant Physiol， 2015， 175： 78-85.

[22] 覃 碧， 王 萌， 薛 松， 等. 巴西橡膠樹1個(gè)Mlo基因克隆及其序列特征分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2013， 29（31）： 21-26.

[23] 覃 碧， 王 萌， 林雨見(jiàn)， 等. 巴西橡膠樹HbMlo9基因克隆及其序列特征分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 33（08）： 47～52.

[24] Wang L F， Wang M， Zhang Y. Effects of powdery mildew infection on chloroplast and mitochondrial functions in rubber tree[J]. Trop Plant Pathol， 2014， 39（3）： 242-250.

[25] Liu W， Da Silva G F， Wu G， et al. Functional and structural roles of residues in the third extramembrane segment of adrenal cytochrome b561[J]. Biochemistry， 2011， 50（15）： 3 149-3 160.

[26] Zhang D L， Su D， Berczi A， et al. An ascorbate-reducible cytochrome b561 is localized in macrophage lysosomes[J]. Biochim Biophys Acta， 2006， 1760（12）： 1 903-1 913.

[27] Griesen D， Su D， Berczi A， et al. Localization of an ascorbate-reducible cytochrome b561 in the plant tonoplast[J]. Plant Physiol， 2004， 134（2）： 726-734.

[28] Lu P， Ma D， Yan C， et al. Structure and mechanism of a eukaryotic transmembrane ascorbate-dependent oxidoreductase[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（5）： 1 813-1 818.

[29] Rahman M M， Nakanishi N， Sakamoto Y， et al. Roles of conserved Arg（72） and Tyr（71） in the ascorbate-specific transmembrane electron transfer catalyzed by Zea mays cytochrome b561[J]. J Biosci Bioeng， 2013， 115（5）： 497-506.

[30] Asard H， Kapila J， Verelst W， et al. Higher-plant plasma membrane cytochrome b561： a protein in search of a function[J]. Protoplasma， 2001， 217（1-3）： 77-93.

[31] Verelst W， Kapila J， De Almeida Engler J， et al. Tissue-specific expression and developmental regulation of cytochrome b561 genes in Arabidopsis thaliana and Raphanus sativus[J]. Physiol Plant， 2004， 120（2）： 312-318.