石亞林，范文來(lái)，徐　巖（江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

白酒抗氧化性的初步研究

石亞林，范文來(lái)*，徐巖
（江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

測(cè)定了幾種不同香型白酒的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除率、總的抗氧化力、還原力、金屬螯合力。結(jié)果表明：白酒具有一定的抗氧化能力，但是相比于其他酒類，其抗氧化能力較低。白酒DPPH自由基清除率平均值為7.80%±2.31%，氧化抑制率平均值為20.50%±8.08%，金屬鰲合能力平均值為1.60%±0.84%，還原能力為0.18±0.06。

白酒，抗氧化力，DPPH，還原力，金屬螯合力

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的蒸餾酒，也是世界七大蒸餾酒之一［1］。白酒是以淀粉或糖為原料，加入糖化發(fā)酵劑，經(jīng)固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而制成的蒸餾酒［2］，在我國(guó)具有悠久的歷史。

隨著人民生活水平的不斷提高，具有抗氧化作用的營(yíng)養(yǎng)素引起了人們的重視［3］。目前普遍使用的人工合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚［3（2）-tert-Butyl-4-hydroxyanisole，BHA］、沒(méi)食子酸丙酯（Propyl gallate，PG）及特丁基對(duì)苯二酚（tert-Butylhydroquinone，TBHQ）有較多的毒副作用，許多國(guó)家都相繼對(duì)其使用進(jìn)行了限制［4］。因此天然抗氧化劑的研究、開(kāi)發(fā)和利用尤其重要［5］。有研究者對(duì)葡萄酒［6-7］、黃酒［8］、啤酒［9］的抗氧化力進(jìn)行了研究。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)白酒的抗氧化性能研究非常少，更沒(méi)有系統(tǒng)的方法來(lái)檢測(cè)白酒的抗氧化活性。因此，本文采用4種不同的抗氧化檢測(cè)方法對(duì)白酒進(jìn)行測(cè)定，最終選出一種適合衡量白酒抗氧化活性并能準(zhǔn)確、快速、方便的檢測(cè)方法（DPPH），并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化改良，為建立規(guī)范的白酒抗氧化活性測(cè)定方法提供技術(shù)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、亞油酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫氰酸銨、氯化亞鐵、鹽酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫-20、BHA、BHT、α-生育酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、Ferrozine、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）、檸檬酸美國(guó)sigma-aldrich公司；實(shí)驗(yàn)所需要的5種不同香型（醬香型、清香型、濃香型、芝麻香型和老白干香型）酒樣由各相應(yīng)酒廠提供。

電熱鼓風(fēng)干燥箱上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；PB2002-N電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋上海華連醫(yī)療器械有限公司；超聲波清洗儀德國(guó)Elma公司；UV-2802S型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；Thermo酶標(biāo)儀Thermo Electron Corporation。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照Shimada等［10］的方法略作改動(dòng)。配制0.1mmol/L的DPPH自由基溶液、1g/L的BHA、BHT、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用?？瞻妆壬苤屑尤?mL超純水，100μL待測(cè)樣品，混勻。最后向上述體系中準(zhǔn)確加入2mL DPPH自由基溶液，充分混勻。于室溫避光靜置30min后，在517nm處測(cè)定吸光值變化。用1g/L人工合成抗氧化劑BHA、BHT、α-生育酚作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算清除率：

其中：A1為待測(cè)樣存在時(shí)的吸光度；A0為對(duì)照樣的吸光度。

1.2.2總抗氧化能力的測(cè)定使用亞油酸體系進(jìn)行測(cè)定［11］。準(zhǔn)確量取2.5mL K3PO4緩沖液（0.04mol/L，pH7.0）和2.5mL亞油酸乳狀液于5mL比色管中，混勻。向上述體系中加入200μL待測(cè)酒樣，充分混勻。將混合反應(yīng)液放入37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每12h取樣100μL，總共取10次。用硫氰酸鹽方法檢測(cè)反應(yīng)體系的氧化程度。檢測(cè)方法：取樣品溶液100μL加入到4.7mL乙醇（75%vol）中，然后加入100μL硫氰酸銨（30%）和100μL FeCl2（濃度為20mmol/L，溶于3.5% HCl中）混勻，在500nm處測(cè)定吸光值變化。用2.5mL的K3PO4緩沖液與2.5mL的亞油酸乳狀液混合液作空白對(duì)照，用1g/L人工合成抗氧化劑BHA、BHT、α-生育酚作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算氧化抑制率：

其中：A1為待測(cè)酒樣存在時(shí)的吸光度；A0為對(duì)照樣的吸光度。

1.2.3還原力的測(cè)定參照Oyaizu等［12］的方法略作改動(dòng)?？瞻妆壬苤屑尤?mL超純水，向其中加入200μL待測(cè)樣，再加入2.5mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）和2.5mL 1%鐵氰化鉀，混合體系于50℃恒溫20min。加入1mL 10%三氯乙酸，3000r/min離心分離10min。取上層清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1% FeCl30.5mL，混合均勻。在700nm處測(cè)定吸光值變化。用1g/L人工合成抗氧化劑BHA、BHT、α-生育酚100μL作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4金屬鰲合能力的測(cè)定參照Decker等［13］的方法略作改動(dòng)。配制2mmol/L的FeCl2溶液、5mmol/L Ferrozine溶液，比色管中加入4.7mL超純水，再向其中加入200μL待測(cè)樣、0.1mL 2mmol/L的FeCl2、0.2mL 5mmol/L Ferrozine。將上述體系置于室溫下，反應(yīng)20min，562nm處測(cè)定吸光值變化。用1mmol/L EDTA和檸檬酸作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算金屬螯合力：

其中：A1為待測(cè)酒樣存在時(shí)的吸光度；A0為對(duì)照樣的吸光度。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)都是經(jīng)過(guò)3個(gè)重復(fù)所得。數(shù)據(jù)采用Origin8.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2　結(jié)果與討論

2.1DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的深紫色自由基，在517nm處有最大吸光值，當(dāng)其從能夠釋放質(zhì)子的物質(zhì)處得到質(zhì)子時(shí)，會(huì)形成一種穩(wěn)定的反磁性分子，其517nm處吸光值會(huì)變小。釋放質(zhì)子是物質(zhì)抗氧化的機(jī)理之一，通過(guò)測(cè)定物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力，可以較迅速地評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力［14］。

從圖1可以看出，在相同條件下，100μL BHA、BHT、α-生育酚、濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒對(duì)DPPH的清除率分別是51.80%± 1.14%、40.20%±0.25%、66.60%±0.33%、4.10%±0.55%、9.70%±0.43%、7.10%±0.13%、5.30%±2.12%、4.40%± 2.24%，均值為7.80%±2.31%。結(jié)果表明，白酒具有一定的DPPH自由基清除能力，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于已知人工合成抗氧化劑，不同香型白酒的自由基清除能力順序?yàn)榍逑阈停踞u香型＞芝麻香型＞老白干香型＞濃香型。文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄酒的DPPH自由基清除率為73.80%±0.11%［7］，黃酒為45.20%±0.24%［8］，啤酒為90%±0.31%［9］，幾種酒的DPPH自由基清除率大小順序?yàn)槠【疲酒咸丫疲军S酒＞白酒。

圖1　待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1　Clearance rate of DPPH free radical activities of samples to be tested

2.2總抗氧化能力

在亞油酸的自氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化物，氧化Fe2+為Fe3+，F(xiàn)e3+與SCN-形成絡(luò)和物，于500nm處有最大吸光值。因此，吸光值越高，表明亞油酸自氧化的程度越高。加入待測(cè)酒樣后，通過(guò)硫氰酸鹽法測(cè)定的亞油酸自氧化程度的吸光值［15］。

圖2　待測(cè)樣品的總抗氧化能力Fig.2　Inhibiting percentages of samples to be tested

從圖2可以看出，100μL BHA、α-生育酚、濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒，反應(yīng)時(shí)間為120h時(shí)，氧化抑制率分別為74.50%±0.15%、84.10%±1.22%、26.50%±2.33%、22.80%±2.06%、22.20%±3.12%、24.40%±4.21%、6.30%±2.12%，均值為20.50%±8.08%。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃酒的氧化抑制率為99.60%±1.35%［8］。這說(shuō)明，白酒雖具有一定的抗氧化能力，但是比黃酒低很多。不同香型白酒的氧化抑制率順序?yàn)闈庀阈停局ヂ橄阈停厩逑阈停踞u香型＞老白干香型。

2.3還原力

還原性是一種物質(zhì)抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)，也是物質(zhì)抗氧化機(jī)理之一。實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)e3+被抗氧化物質(zhì)還原成為Fe2+，測(cè)定結(jié)果中吸光值越大，表明還原能力越強(qiáng)［16］。從圖3可以看出100μL BHA、BHT、α-生育酚、濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒的吸光值分別是0.15±0.02、1.00±0.01、0.61±0.12、0.16±0.26、0.17±0.04、0.28±0.09、0.13±0.01、0.15±0.02，均值為1.60%±0.84%。分析幾組數(shù)據(jù)的差異性，發(fā)現(xiàn)醬香型白酒的還原能力明顯高于其他香型的白酒，但是明顯低于黃酒的還原力0.40±0.03［8］。濃香型、清香型、芝麻香型和老白干香型白酒還原能力幾乎沒(méi)有差異。

圖3　待測(cè)樣品的還原能力Fig.3　Reducing activity of samples to be tested

2.4金屬螯合力

一些金屬離子，如鐵離子、銅離子在脂質(zhì)的氧化過(guò)程中起催化作用，因此具有金屬螯合作用的物質(zhì)可以間接地起到抗氧化的作用［16］。Ferrozine能夠與Fe2+形成紫紅色的絡(luò)合物，當(dāng)其他有競(jìng)爭(zhēng)力的絡(luò)合劑存在時(shí)，紫紅色會(huì)變淺。因此通過(guò)絡(luò)合物顏色的變化，可以評(píng)價(jià)物質(zhì)對(duì)Fe2+的絡(luò)和能力。

從圖4可以看出，白酒金屬螯合能力非常有限。100μL濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒的金屬螯合能力分別是2.73%±0.34%、2.38% ±0.22%、2.37%±0.14%、0.60%±0.03%、1.68%±0.25%，均值為0.18%±0.06%。低于黃酒的金屬螯合力0.90% ±0.03%［8］，而同樣用量的陽(yáng)性對(duì)照EDTA，其金屬螯合能力達(dá)到66.32%±2.35%。這說(shuō)明對(duì)白酒的抗氧化能力不能通過(guò)金屬螯合力衡量。

圖4　待測(cè)樣品的還原能力Fig.4　Chelating activity of samples to be tested

3　結(jié)論

通過(guò)DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力、還原能力、金屬螯合力4種測(cè)量指標(biāo)間接測(cè)定白酒的抗氧化能力。研究結(jié)果表明，白酒有較弱的總抗氧化能力、還原能力、DPPH自由基清除力，但是金屬螯合能力非常有限，不同香型白酒的抗氧化能力不同。4種測(cè)量指標(biāo)的測(cè)量結(jié)果表明，DPPH自由基法能夠準(zhǔn)確清晰地反映白酒的抗氧化活性。初步推測(cè)酚類化合物是引起白酒抗氧化活性的主要物質(zhì)，但是存在于白酒中的其他物質(zhì)也可能具有抗氧化能力，關(guān)于白酒中的具體抗氧化活性物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑仍是今后食品工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，開(kāi)發(fā)實(shí)用、高效、成本低廉的天然抗氧化劑仍是研究的熱點(diǎn)之一［17］。

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Preliminary study on antioxidant activity of Chinese liquor

SHI Ya-lin，F(xiàn)AN Wen-lai*，XU Yan
（Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In this study，2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH），total antioxidant activity，reducing capacity，and chelating capacitywere used to evaluate the antioxidant activity of Chinese liquor.According to each method under study，Chinese liquors had lower antioxidant activity than synthetic antioxidants.The scavenging activity of Chinese liquor was 7.80%±2.31%.The inhibiting percentage was 20.50%±8.08%.The chelating activity was 1.60%±0.84%.The reducing capacity was 0.18±0.06 expressed by absorbance.

liquor；antioxidant activity；DPPH；reducing capacity；chelating activity

TS262.3

A

1002-0306（2015）02-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.011

2014－04－24

石亞林（1991-），女，碩士研究生，研究方向：生物工程。

范文來(lái)（1966-），男，碩士研究生，研究員，研究方向：釀酒工程與發(fā)酵工程。

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102108）。