章浙忠　許健駱豐　楊嘯曉

兒童異型淋巴細胞增多與CMV、EBV感染相關(guān)性研究

章浙忠許健★駱豐楊嘯曉

目的 探討患兒感染CMV、EBV后，異型淋巴細胞數(shù)量與CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平，以及與CMV-DNA和EBV-DNA之間的相關(guān)性，為患兒治療CMV和EBV提供實驗室依據(jù)。方法 收集異型淋巴細胞增多（陽性：異型淋巴細胞＞3%）兒科臨床病例95例，采用ELISA法檢測患者血清中CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平，Real-time PCR法檢測患者CMV-DNA 和EBV-DNA含量，瑞吉染色計數(shù)異型淋巴細胞。結(jié)果 95例異型淋巴細胞陽性患者體內(nèi)CMV-IgM和EBV-IgM陽性率達1.1%和5.3%；CMV-IgG和EBV-IgG陽性率為52.6%和31.6%；PCR結(jié)果顯示CMV-DNA和EB-DNA陽性率分別為17.9%和22.1%。其中50例CMV-IgG檢測陽性的患者CMV-DNA陽性率高達30%；30例EBV-IgG檢測陽性的患者EBV-DNA陽性率高達36.7%；5例EBV-IgM檢測陽性的患者僅1例EB-DNA檢測為陰性。結(jié)論 異型淋巴細胞增多與CMV、EBV感染具有一定的相關(guān)性，且CMV-IgG和EBV-IgG在診療過程中具有一定臨床意義。懷疑患兒感染CMV和EBV時，合并異型淋巴細胞、CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA水平聯(lián)合診斷對臨床具有重要意義。

異型淋巴細胞 巨細胞病毒 EB病毒

異型淋巴細胞又稱病毒細胞、非典型淋巴細胞、傳染性單核細胞等，多見于EB病毒（EBV）和巨細胞病毒（CMV）等感染［1］。傳染性單核細胞增多癥是指EBV感染引起的單核-巨噬細胞系統(tǒng)性增生性傳染病。但近期研究發(fā)現(xiàn)CMV病毒亦可引起傳染性單核細胞增多綜合征［2］，可經(jīng)血清學檢測IgM抗體陽性或PCR檢測DNA陽性診斷［3，4］。作者對血液中存在異型淋巴細胞患者血清中的CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平以及EBV-DNA、CMV-DNA水平進行檢測，并觀察CMV和EBV感染陽性患者外周血中異型淋巴細胞的改變，綜合分析比較它們之間的聯(lián)系，為醫(yī)務(wù)人員診斷EBV和CMV感染提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1標本來源 收集2012年1月至2014年9月于浙江省中醫(yī)院兒科有異型淋巴細胞增多血液標本95例，其中男45例，女50例；1～7歲占84.2%，其他年齡段占15.8%。

1.2儀器與試劑 雙目光學顯微鏡；實時熒光定量PCR儀（ABI，USA，ABI7500）；酶標儀（寶特，USA，ELX808）；EBV核酸定量檢測試劑盒（達安基生物有限公司）； CMV病毒核酸定量檢測試劑盒（達安基生物有限公司）； CMV ELLSA試劑盒（美國美德聲科學技術(shù)公司）；EBV ELISA試劑盒（北京貝爾生物工程有限公司）。瑞吉染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.3方法 （1）按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》［5］的要求制備2張良好血涂片，瑞吉染液染色，異型淋巴細胞數(shù)＞3%為陽性。（2）分離血清用ELISA檢測試劑盒檢測CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平。（3）實時熒光定量PCR儀檢測血標本中CMV-DNA和EBV-DNA水平。①標本處理：患者靜脈血分離血清，取50μl血清加50μlDNA提取液混勻，離心后取含病毒DNA上清液5μl做PCR擴增。②取預(yù)混有引物的PCR反應(yīng)管，加入含病毒DNA上清液，將反應(yīng)管放入PCR儀的樣品槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性、陽性定量質(zhì)控參考品梯度以及未知標本，并設(shè)置樣品名稱、標記熒光基團種類和循環(huán)參數(shù)，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動分析計算出標本數(shù)值（Qty）。③陽性判斷：CMVDNA＞2.5×104copies/ml；EBV-DNA＞5.0×104copies/ml。

2　結(jié)果

2.1瑞氏-吉姆薩染色液染色手工分類 95例標本中89例為單核型的異型淋巴細胞，4例為單核型和和漿細胞型混合感染的異型淋巴細胞，2例為幼稚型的異型淋巴細胞。見圖1～3。

圖1　幼稚細胞型異型淋巴細胞

圖2　單核細胞型異型淋巴細胞

圖3　漿細胞型異型淋巴細胞

2.2異形淋巴細胞陽性患者血清 CMV-IgM、IgG， EBV-IgM、IgG的 ELISA檢測結(jié)果以及EBV-DNA 、CMV-DNA 的PCR檢測結(jié)果 見表1。

表1　異型淋巴細胞檢測陽性血清CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG、EBV-DNA和CMV-DNA檢測結(jié)果（n）

2.3CMV-IgG和EBV-IgG陽性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR檢測結(jié)果 見表2。

表2　CMV-IgG和EBV-IgG陽性患者中CMV-DNA和EBV-DNA 檢測結(jié)果（n）

2.4CMV-IgM和EBV-IgM陽性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR檢測結(jié)果 見表3。

表3　CMV-IgM和EBV-IgM陽性患者血清CMV-DNA和EBV-DNA檢測結(jié)果（n）

3　討論

傳染性單核細胞癥臨床表現(xiàn)以小兒發(fā)熱、咳嗽、淋巴結(jié)和肝脾腫大等癥狀為主［6］。EBV是一種嗜B淋巴細胞的皰疹病毒，可引起典型的傳染性單核細胞增多癥表現(xiàn)［7，8］，或呈隱性感染狀態(tài)并終生帶毒［9，10］。文獻提示EBV可引起腦炎［11］、腦膜炎、多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。CMV具有潛伏-活動的生物學特征［12］，可引起神經(jīng)性耳聾和不同程度的神經(jīng)運動障礙。異常淋巴細胞形態(tài)各異，一般分三型：Ⅰ型為泡沫型，其染色質(zhì)呈粗網(wǎng)或成堆排列，核偏位，胞漿中有大小不一泡沫樣空泡；Ⅱ型是不規(guī)則型，核圓、橢圓或不規(guī)則，染色質(zhì)稍細呈單核樣，胞漿豐富； Ⅲ型是幼稚型，染色質(zhì)細致均勻，可見核仁。對存在異型淋巴細胞患者的血清進行CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA檢測，患者血清中CMV和EBV抗體的檢出說明患者體內(nèi)存在CMV和EBV早期或既往感染，同時也論證了異型淋巴細胞與CMV和EBV具有一定的相關(guān)性。CMV和EBV感染后患者以Ⅱ型異常淋巴細胞為主，主要表現(xiàn)為胞漿增多，染色質(zhì)單核樣改變?yōu)橹?，少見泡沫型和幼稚型?；颊唧w內(nèi)出現(xiàn)的反應(yīng)性變異 T 淋巴細胞增多，故有淋巴結(jié)腫大的表現(xiàn)［13］。

CMV和EBV均屬皰疹病毒科，為雙鏈線狀DNA病毒［14］。兒童主要通過胎盤、母乳等方式感染CMV。當小兒機體免疫缺陷或免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，則易引起肺炎或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙等疾病。EBV具有嗜B淋巴細胞的特征，能夠在已產(chǎn)生抗體的宿主細胞內(nèi)持續(xù)存在［15］。兒童感染EBV后癥狀表現(xiàn)不一，在早期易發(fā)生誤診［16］。CMV-IgM和EBV-IgM可作為急性感染的診斷指標，因半衰期較短，可在體內(nèi)持續(xù)3個月。從患者血清中檢出IgM抗體，表明患者最近發(fā)生了病毒感染。CMV-IgG和EBV-IgG是既往病毒感染后，機體自身免疫產(chǎn)生的抗體，表明患者對該病毒具有免疫力。CMV和EBV DNA呈陽性，表明患者體內(nèi)存在病毒感染。IgM陽性、DNA陽性，考慮急性的早期感染期已過，IgM型抗體在血中的滴度已下降，機體通過自身免疫開始產(chǎn)生抗病毒的IgG，病毒還在機體內(nèi)不斷復制［17］。不容忽視的是，CMV和EBV均具有潛伏性，因此極有可能在潛伏期后，人體抵抗力低下時，又出現(xiàn)病毒活動。因此兒童在CMV-IgG和EBVIgG檢測為陽性，且符合病毒感染癥狀時，更應(yīng)注重CMV-DNA和EBV-DNA的及時檢測。對CMV-IgM和EBV-IgM陽性患兒的血清同時進行PCR檢測，當IgM和DNA均呈陽性時，既是發(fā)病早期又是病毒復制期（但兒童患者免疫反應(yīng)較弱，可呈假陰性），故應(yīng)積極治療，避免病情的加重。

不同方法的檢測結(jié)果代表著不同的臨床意義，ELISA法雖然特異性較高，但病毒需達到納克水平。PCR檢測具有敏感度高，快速簡便等優(yōu)點，但特異性不高。因此，懷疑患兒感染CMV和EBV時，對異型淋巴細胞以及CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG和EBV-DNA聯(lián)合檢測對診斷具有重要的意義，為臨床醫(yī)生綜合分析病情，降低誤診，及早、及時、有效治療表明患者體內(nèi)存在病毒感染。IgG陽性、DNA陽性感染患兒提供實驗室依據(jù)。

1 朱云波,夏小梅,李榮龍,等.197例兒童異型淋巴細胞的檢測及臨床病因分析.中國醫(yī)學創(chuàng)新,2012,9（20）：94～95.

2 王春瑋.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測在嬰兒人巨細胞病毒感染中的臨床意義.實用醫(yī)技雜志,2014,21（2）：178～179.

3 羅榮華,陳曉云,袁玉美,等.兒童外周血EB病毒DNA檢測的臨床意義.中國臨床研究,2011,24（6）：469～471.

4 Wang Xia, Yang Kun, Wei C, et al. Co-infection with EBV/CMV and other respiratory agents in children with suspected infectious mononucleosis.Virology Journal,2010,7（1）：247.

5 葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜,等.全國臨床檢驗操作規(guī)程.第三版.南京：東南大學出版社,2006.123～124.

6 Olson D, Huntington MK. Co-infection with cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in mononucleosis. Case report and review of literature. S D Med,2009,62（9）：349～353.

7 Guerrero-Ramos A,Patel M, Kadakia K, et al. Performance of the architect EBV antibody panel for determination of Epstein-Barr virus infection stage in immunocompetent adolescents and young adults with clinical suspicion of infectious mononucleosis. Clinical and Vaccine Immunology, 2014, 21（6）：817～823.

8 Ayako Arai, Takeshi Yamaguchi, Honami Komatsu, et al. Infectious mononucleosis accompanied by clonal proliferation of EBV-infected cells and infection of CD8-positive cells.International Journal of Hematology, 2014, 99（5）：671～675.

9 A.M. Leen, C.M. Bollard,A. Mendizabal, et al. Most Closely HLAMatched Allogeneic Virus Specific Cytotoxic T-Lymphocytes （CTL） to Treat Persistent Reactivation or Infection With Adenovirus, CMV and EBV After Hemopoietic Stem Cell Transplantation （HSCT）.Biology of Blood and Marrow Transplantation,2011,17（2）：S151～S152.

10 Dominik Bettenworth, Ross Matthias, Markus B., et al. Mo1250 Cytomegalovirus （CMV） and Epstein Barr Virus （EBV） Specific ELISPOT Assays Detect Frequent Reactivation of CMV and EBV in Inflammatory Bowel Disease.Gastroenterology,2014,146（5）：S597.

11 郭偉立,韓虹,石凱麗,等.EB病毒性腦炎患兒淋巴細胞免疫功能研究.中國藥物與臨床,2014,14（1）：124～126.

12 Catherine Hyams, Diana A, Mabayoje,et al. Serological cross reactivity to CMV and EBV causes problems in the diagnosis of acute hepatitis E virus infection.Chinese Remedies & Clinics ,2014,86（3）：478～483.

13 陳德林,潘麗.48例傳染性單核細胞增多癥患兒EB病毒核酸定量和異型淋巴細胞的實驗室臨床意義.中國實用醫(yī)藥,2013,8（18）：144～145.

14 邊鵬.80例兒童巨細胞病毒感染患者臨床治療分析.中外醫(yī)療,2013,32（26）：55～56.

15 Hurt C, Tammaro D. Diagnositic evaluation of mononucleosis like illnesses.Am J Med,2007,120（10）：911～918.

16 朱芹,郭平,黃雅娟,等.EB病毒血清學聯(lián)合DNA定量檢測在診斷嬰兒傳染性單核細胞增多癥中的意義.中國現(xiàn)代醫(yī)生,2014,52（11）：56～58.

17 Noyola DE,Demmler GJ, Williamson WD, et al. Cytomegalovirus urinary excretion and long term outcome in children with congenital cytomegalovirus infection.Pediatric Infectious Disease Journal, 2000, 19（6）： 505～510.

Objective Probe the correlation of atypical lymphocyte with CMV-IgM， CMV-IgG， CMV-DNA， EBV-IgM， EBV-IgG and EBV-DNA in pediatric patients， provide experimental basis for treatment of CMV and EBV infection in children patients. Methods Collected 95 samples of atypical lymphocyte more than 3% from clinic pediatrics， detected the level of CMV-IgM， CMV-IgG， EBV-IgM and EBV-IgG by ELISA， analyzed the copies of CMV-DNA and EBV-DNA with real time PCR， and the peripheral blood smears were stained by Wright-Giemsa. Results There were 1.1% CMV-IgM， 5.3% EBV-IgM， 52.6% CMV-IgG and 31.6% EBV-IgG positive were discovered in 95 children patients of atypical lymphocyte increased by ELIAS， 17.9% CMV-DNA and 22.1% EBV-DNA were confi rmed by PCR， respectively. 30% CMV-DNA positive patients were found at 50 samples with CMV-IgG； 36.7% EBV-DNA were found at 30 cases with EBV-IgG. There was only one EBV-DNA negative in 5 casws with EBV-IgM. Conclusion Results showed that atypical lymphocyte increased has correlation with CMV-DNA， EBV-DNA， CMV-IgG and EBV-IgG， it will provide a clinical reference for the diagnosis and treatment of CMV and EB infection.

Atypical lymphocyte CMV EBV

浙江省科技廳錢江人才項目（2013R10072）； 浙江省自然科學基金（LY14H160037）

310012 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院（章浙忠 駱豐 楊嘯曉）310053 浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術(shù)學院（許?。?通訊作者