王瑞聰?shù)?/p>

摘要：以不同劑量NaN3處理馬齒莧種子，從種子萌發(fā)、植株生長、光合性能的角度確定最適NaN3處理劑量，并分析以葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)方法輔助篩選的可行性。結(jié)果表明，1.0 mmol/L NaN3處理8 h或0.5 mmol/L NaN3處理12 h均可顯著提高種子萌發(fā)率和萌發(fā)質(zhì)量，而更高濃度、更長時間的處理則使萌發(fā)率和萌發(fā)質(zhì)量逐漸下降；根據(jù)長勢初篩后的各處理組種子萌發(fā)苗，其株高均高于對照或與對照相當(dāng)，單葉面積（2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組除外）則低于對照；各處理組葉片PSⅡ的潛在和實(shí)際光化學(xué)效率普遍高于對照（其中2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組最高），但除2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組外，各組對高光強(qiáng)的抵御能力，特別是快速保護(hù)能力均有所下降。2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組中馬齒莧種子獲得植株的株型最高、單葉面積最大、潛在和實(shí)際光化學(xué)活性最強(qiáng)、抵御強(qiáng)光脅迫能力最強(qiáng)?？梢?，以2.0 mmol/L NaN3處理8 h是馬齒莧種子的最適處理?xiàng)l件，而采用葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)分析技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對當(dāng)代植株光合能力、高光強(qiáng)抗性的無損傷分析，極有利于提高篩選效率。

關(guān)鍵詞：馬齒莧；NaN3；種子萌發(fā)；生長；葉綠素?zé)晒?/p>

中圖分類號：S335；Q945.34文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0224-05

馬齒莧（Portulaca oleracea）別稱馬齒菜、長生菜、五行草等，為馬齒莧科（Portulacease）馬齒莧屬（Portulaca）的一年生肉質(zhì)草本植物。馬齒莧的蛋白質(zhì)、總黃酮含量高，氨基酸種類齊全，富含ω-3不飽和脂肪酸、鉀元素，并含有去甲腎上腺素、褪黑激素等多種保健營養(yǎng)成分，具有改善血液循環(huán)、提高人體免疫力、防治心血管疾病、抑制微生物生長等多重功效[1-3]。此外，馬齒莧對高溫、干旱、高濕、高鹽、重金屬污染等逆境的抵抗能力強(qiáng)大，且是優(yōu)良的生態(tài)修復(fù)植物[4]。馬齒莧集保健、食用、藥用、生態(tài)價值于一身，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的意義。

我國馬齒莧主要以野生狀態(tài)存在，其株形匍匐、分枝多、抗白粉病能力弱、主要生長于盛夏高溫季節(jié)等原因限制了馬齒莧的開發(fā)應(yīng)用及推廣。為改善這一現(xiàn)狀，須篩選并培育出株形高大、生長旺盛、適應(yīng)范圍廣的馬齒莧新種質(zhì)。誘變育種是獲得新種質(zhì)最常見的方法，而由于化學(xué)誘變操作簡便、對設(shè)備依賴程度低等原因，使其在該領(lǐng)域占有重要地位[5]?；瘜W(xué)誘變多為隱性突變，遺傳變異須在誘變后的子一代甚至子二代中才能被檢出[6-7]，使得誘變育種的最大工作量集中于篩選，而尋找簡便有效的篩選方法始終是誘變育種的主題和難題。傳統(tǒng)研究中多數(shù)選擇半致死劑量（LD50）作為誘導(dǎo)最適劑量[8]，或以子一代、子二代的葉色變化代表誘變率來篩選最適劑量，并直接對目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選。近年來得以發(fā)展的RAPD、SRAP多態(tài)性等分子生物學(xué)方法，對于從遺傳學(xué)角度輔助確立最適劑量，以及確定是否發(fā)生了可穩(wěn)定的突變發(fā)揮著越來越大的作用。但由于致死不與誘變直接相關(guān)，葉色異常、DNA指紋圖譜等不與目標(biāo)優(yōu)良性狀直接相關(guān)，且RAPD、SRAP等方法步驟繁瑣、耗時耗材，致使誘變劑量的確定及后續(xù)突變株的篩選成為誘變育種中最關(guān)鍵、最耗時的步驟。

近年來得以發(fā)展的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)，可快速、高效、無損傷地檢測植物的實(shí)際和潛在光合能力、抗逆境脅迫能力等，從而在光合、生態(tài)、品種篩選上發(fā)揮著越來越大的作用[9-10]。誘變育種中對目標(biāo)性狀篩選前，先利用葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)將正常及逆境條件下光合能力增強(qiáng)的植株篩選出，將便于長勢旺盛的突變株及目標(biāo)株系的篩選，極大減少目標(biāo)性狀篩選的工作量。而關(guān)于葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)輔助篩選突變株的報(bào)道尚較少。

NaN3具有高效、低毒、價廉、使用安全等優(yōu)點(diǎn)，是一種常用的化學(xué)點(diǎn)突變誘變劑[11-12]。本研究在不同處理濃度、處理時間下以NaN3處理馬齒莧種子，通過綜合比較種子萌發(fā)速度、萌發(fā)質(zhì)量、誘變當(dāng)代植株的形態(tài)和長勢、葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)等，得到最佳的NaN3處理濃度和處理時間，并初步篩選植株高、長勢旺盛、抗逆能力強(qiáng)的潛在優(yōu)良植株，為葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)在誘變育種中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

馬齒莧種子于2012年9月下旬采自南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物園。試驗(yàn)分為2個部分，即分析NaN3處理對馬齒莧種子萌發(fā)的影響；比較經(jīng)NaN3處理后各組幼苗生長、光合性能的變化。

1.1種子萌發(fā)

選擇飽滿、整齊的種子并均分為10組，每組設(shè)3個重復(fù)。各組分別用0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L NaN3溶液（pH值為4）浸種8、12 h，并用清水沖洗30 min，其中8 h處理組須再用清水浸種4 h以達(dá)到12 h的最佳浸種時間[11]。參照楊子儀等的培養(yǎng)皿濾紙法[13]，于CONVIRON A-1000型人工智能生物物候培養(yǎng)箱[14 h/10 h（L/D），32 ℃/28 ℃，照度300 μmol/（m2·s），相對濕度（RH） 65%]中萌發(fā)種子并記錄萌發(fā)種子數(shù)，萌發(fā)結(jié)束時每組隨機(jī)選取20棵幼苗測定其胚根與下胚軸的長度，并計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。

1.2幼苗培養(yǎng)

將萌發(fā)的芽苗移入Jiffy泥炭育苗塊中，置于CONVIRON A-1000型人工智能生物物候培養(yǎng)箱[14 h/10 h（L/D），32 ℃/28 ℃，照度300 μmol/（m2·s），RH 65%]中培養(yǎng)。10 d后篩選長勢優(yōu)良的幼苗20株并繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長至約15 cm時對各植株進(jìn)行葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)指標(biāo)的測定；45 d時測定各植株的生長相關(guān)指標(biāo)，并在生長后期種子成熟時收集種子。

1.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

利用FC-1000-H型便攜式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈾z測。該系統(tǒng)提供的測量光為620 nm紅光，強(qiáng)度為500 μmol/（m2·s），照度為500 μmol/（m2·s），持續(xù)時間為2 min；飽和脈沖強(qiáng)度為1 800 μmol/（m2·s），持續(xù)時間為0.8 s。

首先選取馬齒莧植株上的第5張完全展開葉，暗適應(yīng) 20 min 后測量最小熒光Fo和暗適應(yīng)下的最大熒光Fm；隨后打開光化學(xué)誘導(dǎo)熒光動力學(xué)程序，并間隔30 s打開飽和脈沖測量光適應(yīng)下的最大熒光Fm′；光化學(xué)光持續(xù)10 min后將其關(guān)閉，并在關(guān)閉后第60、100、1 000 s分別打開飽和脈沖測量最大熒光Fm″。

熒光參數(shù)的定義采用van Kootan等的方法[14]，并由儀器自帶軟件完成計(jì)算。光化學(xué)光關(guān)閉后100、1 000 s時的非光化學(xué)淬滅，與光化學(xué)光打開時非光化學(xué)淬滅的差值分別為qE、qT，1 000 s 時的非光化學(xué)淬滅為qI[15]。

1.4生長指標(biāo)的檢測

馬齒莧移栽45 d后用直尺測量其株高，并采用ADC-AM300 型多用途葉面積儀測量第5張完全展開葉的面積。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 6軟件制作圖表。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，表中不同小寫字母表示在單因素方差分析時不同處理間差異顯著（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1NaN3處理對種子萌發(fā)的影響

以不同濃度NaN3溶液浸種，分別處理馬齒莧種子8、12 h，再在正常條件下萌發(fā)。由圖1-A、圖1-C可知，NaN3處理8、12 h對種子初始萌動時間的影響不大，但隨萌發(fā)時間的延長，濃度≤1.0 mmol/L的NaN3處理可顯著提高種子的累計(jì)萌發(fā)率；1.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的累計(jì)萌發(fā)率最高，高達(dá)80.67%±5.7%；0.5、1.0 mmol/L NaN3 12 h處理組對種子萌發(fā)的促進(jìn)效果相當(dāng)；2.0 mmol/L NaN3處理8 h與1.5～2.0 mmol/L NaN3處理12 h則顯著降低了種子的累計(jì)萌發(fā)率和最終萌發(fā)率（表1）。

NaN3處理不僅影響種子的萌發(fā)速度和萌發(fā)率，對芽苗質(zhì)量也有一定影響（表1）。0.5 mmol/L NaN3處理8 h時，芽苗下胚軸長度、胚根長度均顯著高于對照，但隨著NaN3處理濃度的增加，當(dāng)處理時間延長至12 h，芽苗的胚根長度、胚軸長度逐漸下降（圖1-B、圖1-D）。雖然馬齒莧種子的萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)對NaN3處理更為敏感，但低濃度、短時間的NaN3處理能提高馬齒莧種子的萌發(fā)速度和質(zhì)量，反之則表現(xiàn)為抑制。

2.2NaN3處理對馬齒莧生長的影響

為檢測NaN3處理對馬齒莧幼苗的生長是否有影響，經(jīng)NaN3處理的種子萌發(fā)后將其移栽到育苗塊于正常條件下培養(yǎng)，并間苗留下優(yōu)勢株，45 d后比較馬齒莧植株株高、第5張全展葉的葉面積（表2）。除0.5、2.0 mmol/L 12 h處理組外，各組的馬齒莧株高均顯著高于對照，但各組間差距較小，其中 2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的平均株高最高；0.5～1.5 mmol/L NaN3 8 h各處理組以及1.0～2.0 mmol/L NaN3 12 h各處理組的單葉面積均小于或接近于對照，其中2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組顯著高于其他組?？梢姡琋aN3處理馬齒莧種子可顯著提高馬齒莧株高，但多數(shù)情況下會減小單葉面積。在本試驗(yàn)的處理濃度及處理時間范圍內(nèi)，2.0 mmol/L NaN3處理8 h時，馬齒莧植株的單葉面積穩(wěn)中有升，且株高增幅最大（較對照提高21.36%），表明 2.0 mmol/L NaN3處理馬齒莧種子8 h可顯著提高植株長勢。

2.3NaN3處理對馬齒莧植株光合性能的影響

在葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)中，F(xiàn)v/Fm值代表PSⅡ的最大光化學(xué)效率，絕大多數(shù)正常生長植物的Fv/Fm值恒定在0.80～0.85范圍內(nèi)，而Fv/Fo值則代表實(shí)際檢測條件下PSⅡ的光化學(xué)活性[16]。由表3可知，對照組馬齒莧葉片的Fv/Fm值高達(dá)

表2NaN3處理對馬齒莧株高和第5張全展葉葉面積的影響

0.850，表明馬齒莧葉片的潛在光合性能很高，而各NaN3處理組植株葉片的Fv/Fm值均顯著高于對照，其中2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的Fv/Fm值高達(dá)0.865；各NaN3處理組的Fv/Fo值均顯著高于對照，同樣以2.0 mmol/L NaN3 8 h 處理組最高，高達(dá)6.38?？梢?，以NaN3處理馬齒莧種子不僅能提高植株葉片的潛在光化學(xué)性能，還可顯著提高植株的實(shí)際光化學(xué)活性，從而提高植株的實(shí)際光合能力。就馬齒莧而言，以表3NaN3處理對馬齒莧葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.0 mmol/L NaN3處理種子8 h對于植物潛在、實(shí)際光合性能的提高最有利。

植物葉綠素吸收的光能不僅用于光化學(xué)反應(yīng)，還有部分能量用于非光化學(xué)耗散（NPQ）。非光化學(xué)耗散所消耗的能量主要包括qE、qT、qI，分別表示植物在高光強(qiáng)不同階段的光保護(hù)能力[14，17-18]。

qE通過提高內(nèi)囊體內(nèi)側(cè)的pH值，并誘導(dǎo)激發(fā)態(tài)葉綠素分子中過量的光能以熱的形式耗散，從而對激發(fā)態(tài)葉綠素淬滅，減少強(qiáng)光誘變下自由基的產(chǎn)生，以減少細(xì)胞損傷[18-19]。qE使葉片在幾秒至幾分鐘內(nèi)快速對強(qiáng)光誘變作出調(diào)節(jié)，減輕植物受到的光誘變傷害。qE/NPQ的值越大，表明植物對強(qiáng)光環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)。在飽和脈沖刺激下，0.5、2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的qE/NPQ值均與對照相當(dāng)，2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組顯著高于0.5 mmol/L NaN38 h處理組，而其余各組的qE/NPQ值均顯著低于對照?？梢娫谡ＩL情況下，NaN3處理馬齒莧種子可促進(jìn)植株潛在光合性能、實(shí)際光化學(xué)效率的提高，但在強(qiáng)光脅迫下，多數(shù)處理組植株對光脅迫的快速保護(hù)能力下降，而2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組植株對光脅迫的快速保護(hù)能力穩(wěn)中有升。

qT在三者中所占比例最小，代表激發(fā)能由PSⅡ向PSⅠ分配的情況。強(qiáng)光刺激下qT升高表明在幾分鐘內(nèi)促進(jìn)能量由PSⅡ向PSⅠ分配，從而避免PSⅡ的光能吸收過量而引起光損傷[20]。在本試驗(yàn)的NaN3處理濃度、處理時間范圍內(nèi)，只有0.5、2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的qT/NPQ值與對照差異不顯著，其余各處理組均顯著高于對照?？梢?，雖然各處理組對光脅迫的快速保護(hù)能力下降，但仍可通過將激發(fā)能由PSⅡ向PSⅠ轉(zhuǎn)移，從而在幾分鐘內(nèi)提高植株對光脅迫的保護(hù)能力，此保護(hù)能力相對較小。0.5、2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的植株能量由PSⅡ向PSⅠ的分配比例與對照相當(dāng)。

在強(qiáng)光下，反應(yīng)中心D1蛋白受損傷的速度超過其修復(fù)速度，qI代表捕光色素蛋白復(fù)合體吸收的光能未被有效利用而引起的能量耗散，這部分能量主要轉(zhuǎn)化為熱能或形成活性氧[18]。雖然qI是光損傷和光保護(hù)混合作用的結(jié)果，但qI/NPQ的值越大往往代表植物所受的光抑制越強(qiáng)[18，21]。由表3可知，2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的 qI/NPQ 值與對照相當(dāng)，而其余各組均顯著高于對照，且各12 h處理組的 qI/NPQ 值顯著高于各8 h處理組。可見，除2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組外，其余各處理組植株在強(qiáng)光下的損傷均顯著高于對照組，且植物在強(qiáng)光下的保護(hù)能力隨NaN3處理時間的延長而減弱。

3結(jié)論與討論

NaN3作為一種高效的誘變劑，被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、西瓜的種子處理以及組織培養(yǎng)中的外植體處理，以促進(jìn)誘變的發(fā)生。NaN3誘變時，突變多為隱性突變，且具有無定向性等特點(diǎn)，導(dǎo)致誘變處理后多數(shù)植株長勢減弱，目標(biāo)性狀在子一代或子二代后才能顯現(xiàn)。若以種子萌發(fā)勢、當(dāng)代或子一代植株葉片畸形率等來確定最適劑量，則可能導(dǎo)致大量后代植株長勢偏弱，這與目標(biāo)性狀的篩選相違背；因此，本研究綜合種子萌發(fā)、植株長勢、光合能力來確定NaN3的最適處理劑量，并采用葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)輔助篩選抗性較強(qiáng)的植株，以加速篩選進(jìn)程。

絕大多數(shù)研究結(jié)果表明，NaN3處理可延緩種子萌發(fā)并降低種子萌發(fā)率[6，11]。而本研究中，1.0 mmol/L NaN3處理8 h或 0.5 mmol/L NaN3處理12 h均可顯著提高種子的萌發(fā)率及萌發(fā)質(zhì)量；更高處理濃度、更長處理時間則會使馬齒莧種子的萌發(fā)率、萌發(fā)質(zhì)量逐漸下降。馬齒莧種子對NaN3處理的抗性大于其他種子，因此不應(yīng)采用常規(guī)半致死率來確定馬齒莧種子的最適NaN3誘變劑量。

將萌發(fā)種子在育苗塊上培養(yǎng)，間苗篩選留下長勢旺盛的植株，并比較各組植物的生長及光合性能。結(jié)果顯示，初篩后各處理組植株的株高均高于對照或與對照相當(dāng)，且正常生長條件下植株的潛在（Fv/Fm值）、實(shí)際光化學(xué)活性（Fv/Fo值）均強(qiáng)于對照或與對照相當(dāng)[16]，但各處理組增大幅度不一。雖然活力指數(shù)對NaN3處理最敏感，但株型最高、光合性能最強(qiáng)的2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組在種子萌發(fā)期的活力指數(shù)為 57.49%?？梢?，為使后代植株中出現(xiàn)更多長勢旺盛、光合能力強(qiáng)的植株，應(yīng)綜合萌發(fā)質(zhì)量、長勢、光合能力等指標(biāo)來確定NaN3的最適處理劑量。

正常條件下生長旺盛的植株不一定具有高抗性，而農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生長旺盛、抗性強(qiáng)的植株更具有應(yīng)用價值。若在當(dāng)代先篩選長勢旺盛、光合能力強(qiáng)的植株，并在子一代篩選抗性強(qiáng)的植株，則會遺漏當(dāng)代植株中長勢不強(qiáng)但抗性較強(qiáng)的植株，同時增加子一代植株的篩選工作量。若能篩選當(dāng)代植株中長勢旺盛且抗性強(qiáng)的植株，對減少遺漏、加快篩選進(jìn)程、減少工作量等極為有利。

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)可通過改變外源光強(qiáng)，無損傷檢測植株在正常光強(qiáng)下的光合性能，及其在強(qiáng)光下非光化學(xué)淬滅各組分比例（qE/NPQ、qT/NPQ、qI/NPQ）的變化，并分析植株在正常條件下的光合潛能和高光強(qiáng)抵御能力[21]。該方法已在優(yōu)良品種的抗性篩選上發(fā)揮了一定作用。本研究以此方法分析正常生長條件下馬齒莧植株的抗逆能力，并綜合植株的其他性狀選擇NaN3最適處理劑量和目標(biāo)性狀的備選株系。結(jié)果表明，NaN3處理可提高植株在正常條件下的光合性能，但也會導(dǎo)致多數(shù)植物對高光強(qiáng)逆境的抵御能力減弱。NaN3處理降低了除2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組外其余各組植物對光脅迫的快速保護(hù)能力（qE/NPQ），并促進(jìn)其將PSⅡ吸收的多余能量向PSⅠ轉(zhuǎn)移的能力（qT/NPQ），而由于此能力有限，最終導(dǎo)致這些植株在強(qiáng)光下的損傷高于對照 （qI/NPQ）。2.0 mmol/L NaN3 8 h處理組的植株不僅PSⅡ的潛在（Fv/Fm）、實(shí)際光化學(xué)性能（Fv/Fo）提升幅度最大，且該組植物在強(qiáng)光脅迫下可將非光化學(xué)淬滅中的能量更多地應(yīng)用于快速光保護(hù)（qE/NPQ），而用于熱耗散和產(chǎn)生自由基的能量比例相應(yīng)減少（qT/NPQ），最終導(dǎo)致植物對高光強(qiáng)的抵御能力增強(qiáng)。試驗(yàn)證實(shí)了正常條件下長勢旺盛的植株，其抗逆性不一定強(qiáng)；利用葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)可無損傷篩選同時具有光合旺盛、抗逆性強(qiáng)特性的植株。

綜合不同濃度NaN3處理下的種子萌發(fā)質(zhì)量、初篩后植株的長勢、植株光合能力、抗高光強(qiáng)能力可知，以2.0 mmol/L NaN3處理8 h是馬齒莧種子的最適處理?xiàng)l件；采用葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)分析技術(shù)分析植株的潛在和實(shí)際光合性能、抗高光強(qiáng)能力，極大地提高篩選效率。后續(xù)研究將對收集的種子在子一代中進(jìn)一步篩選，以篩選出生長旺盛、抗性強(qiáng)、抗白粉病、營養(yǎng)豐富的馬齒莧種質(zhì)。

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