趙柏霞等

摘要：為探討拮抗菌YH6在食品工程中的應用潛力，通過形態(tài)觀察及16S rDNA序列分析確定了其分類地位，采用牛津杯法測定其發(fā)酵液的抑菌活性，并采用單因素試驗與正交設計方法篩選出該菌株的優(yōu)化發(fā)酵配方和發(fā)酵條件。結果表明，YH6為球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）；該菌株發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有較強的抑制活性。培養(yǎng)基優(yōu)化組合為：甘薯粉8.0 g/L、硫酸銨 10.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、NaCl 2.0 g/L、CaCO3 1.0 g/L，優(yōu)化發(fā)酵條件為：初始pH值8.0、發(fā)酵時間5 d、發(fā)酵溫度28 ℃、接種量8%、裝液量50 mL/250 mL、轉速120 r/min。

關鍵詞：抑菌活性；放線菌；分類鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號： S482.2+8文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0180-04

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、大腸桿菌（Escherichia coli）是動物和人類化膿感染中最常見的病原菌[1]，在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可以找到，因此，食品受其污染的機會很多，產生的腸毒素可以沾染食物而致食物中毒。

放線菌是生物農藥中農用抗生素制劑的重要來源，已研制開發(fā)具有較強抗菌防病作用的放線菌源農用抗生素如放線菌酮、井岡霉素、中生菌素、春雷霉素、武夷菌素、農抗120、多抗霉素等，均已成功應用于植物各種病害的生物防治[2-3]。海洋環(huán)境特殊，孕育著豐富的微生物資源，包括能產生各種次級代謝產物的海洋放線菌，并且也有從海水中篩選出許多對植物病原真菌、細菌病害以及對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抗菌活性的放線菌，因此，海洋放線菌在新型代謝產物以及生物農藥的開發(fā)方面具有巨大的潛力[4-8]。

本研究室從海洋沉積物中篩選到1株對金黃色葡萄球菌具有強拮抗活性的放線菌株YH6，對該菌進行形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，并對其發(fā)酵培養(yǎng)液成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為進一步研究抗菌機制、測定活性物質結構和產業(yè)化開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：拮抗菌YH6由大連開發(fā)區(qū)泊石灣海泥中分離獲得；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌由筆者所在的研究室分離鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基：A～D號發(fā)酵培養(yǎng)基（A培養(yǎng)基，馬鈴薯20%、葡萄糖2%；B培養(yǎng)基，大豆粉1%、葡萄糖1%、氯化鈉0.25%、碳酸鈣0.2%、蛋白胨0.3%；C培養(yǎng)基，葡萄糖1%、蛋白胨0.3%、氯化鈉0.25%、碳酸鈣0.2%；D培養(yǎng)基，葡萄糖2%、大豆粉2%、蛋白胨0.3%、硫酸銨0.2%、硫酸鎂005%、碳酸鈣0.6%，pH值7.8-8.0；LB培養(yǎng)基，胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5 %、NaCl 1%、瓊脂1.5%，pH值7.8～80）。A～D培養(yǎng)基用于菌株YH6發(fā)酵液的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基用于指示菌培養(yǎng)以及抑菌活性的測定。

主要試驗儀器：ZHWY211B型恒溫搖床（上海，智誠公司）；CT15RT冷凍離心機（上海，天美公司）；TC-512型PCR擴增儀（英國，Techne公司）；S-4800型掃描電鏡（日本，日立公司）。

1.2拮抗菌YH6的分類鑒定

1.2.1形態(tài)特征觀察在高氏1號培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落形態(tài)、菌絲顏色及是否產生色素。

1.2.216S rDNA序列測定及分析采用微波法[8]提取拮抗菌株YH6總DNA，應用通用引物（F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）進行16S rDNA的PCR擴增?？寺y序后，將測得的16S rDNA全序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得序列登錄號，并應用MEGA 5.0軟件在Ezbiocloud（www.ezbiocloud.net）數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索，與已報道的放線菌模式菌株的16S rDNA全系列進行比對分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3YH6抑菌譜測定

采用牛津杯法分別測定菌株YH6發(fā)酵液的上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，以無菌培養(yǎng)液為對照。

1.4發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1最佳基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選以A～D號培養(yǎng)基作為初始的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以10%的濃度接種100 mL菌株YH6的發(fā)酵液，置于28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，5 d后發(fā)酵液經過8 000 r/min離心，取100 μL上清，并采用牛津杯法測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，篩選出最適的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)基的成分優(yōu)化碳源：以“1.4.1”節(jié)中篩選出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，在其中分別用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、甘薯淀粉分別替換碳源，并以原始培養(yǎng)基作為對照。氮源：分別用大豆粉、酵母粉、牛肉膏、（NH4）2SO4等分別替換氮源，以原始培養(yǎng)基作對照。上述試驗均在 28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5 d，離心發(fā)酵液，并取上清液測定其活性，每個處理進行3次重復。根據(jù)試驗結果選用4因素3水平的L9（34）正交試驗優(yōu)化篩選最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合。

1.4.3發(fā)酵條件的優(yōu)化以“1.4.2”節(jié)得到的優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別改變培養(yǎng)基的初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發(fā)酵溫度（21、25、28、31、34、37 ℃）和發(fā)酵時間（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d），以發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標，確定最佳pH值、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間；在篩選出的最佳pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的條件下改變接種量（1%、3%、5%、8%、10%、15%）、裝液量（250 mL三角瓶分別裝液25、50、75、100、125、150、175 mL）、轉速（100、120、150、180、200 r/min）進行培養(yǎng)，發(fā)酵液經上述處理后測定對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制活性，確定最佳發(fā)酵條件，每組處理重復3次。

2結果與分析

2.1拮抗菌YH6的生物學特性及分類鑒定

2.1.1形態(tài)學鑒定拮抗菌YH6在高氏1號培養(yǎng)基上氣絲粉狀，秸草色、乳脂色或微黃秸草色，基絲無色，有時反面微黃色。掃描電鏡觀察（圖1）孢子絲非螺旋形，長條狀，孢子圓柱形，表面光滑。

2.1.216S rDNA測序結果分析YH6總DNA經PCR擴增得到1條約為1.5 kb的特征條帶，回收后連接轉化，陽性克隆子菌液測序，得到序列長為1 431 bp，GenBank登錄號為HQ696549 。將該序列與Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫中的相應序列進行比對，構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），并結合形態(tài)特征，分析結果表明，YH6菌株與球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）的同源性最高，初步將該菌鑒定為球孢鏈霉菌。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

2.2.1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選利用A～D等4種培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，B培養(yǎng)基產生活性物質較多，抑菌圈直徑可達253 mm；A培養(yǎng)基產生的活性物質最少，抑菌圈直徑僅為10.7 mm；而C、D培養(yǎng)基產生活性物質的抑菌圈直徑分別為20.5、15.0 mm（圖3）。表明B培養(yǎng)基為最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2.2最佳碳源、氮源的篩選不同碳源對YH6發(fā)酵液的抑菌效果見圖4-A，從強到弱依次為甘薯粉>蔗糖>淀粉>玉米粉>葡萄糖，選擇甘薯粉為最佳碳源；不同氮源抑菌活性見圖4-B，從強到弱依次為硫酸銨>大豆粉>牛肉膏>酵母粉，因此選用硫酸銨作為最佳氮源。

2.2.3碳源、氮源、無機鹽配比的正交優(yōu)化根據(jù)單因素碳氮源篩選結果，選取4因素3水平的L9（34）正交表設計9種不同的培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)試驗，結果（表1）表明，甘薯粉對

活性物質產生影響最大，CaCO3 影響最小，其優(yōu)化后的最佳發(fā)酵配方為A1B2C1D1，即甘薯粉8.0 g/L，硫酸銨 10.0 g/L，NaCl 2.0 g/L，CaCO3 1.0 g/L。

2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1初始pH值發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對活性物質的產生影響較小，當初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為8.0時，抑菌活性最強；在pH值為5.0時，活性物質產生達到最低值。與pH值自然的發(fā)酵液相比，pH值調為8.0時抑菌活性增加12.4%，因此發(fā)酵的最佳初始pH值為8.0（圖5-A）。

2.3.2發(fā)酵溫度培養(yǎng)溫度對YH6產生活性物質的影響較大，在21～28 ℃抑菌活性緩慢增強，在28 ℃達到最大，當溫度超過28 ℃時抑菌活性明顯下降，因此，該菌株產生活性物質的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃（圖5-B）。

2.3.3發(fā)酵時間拮抗菌YH6在優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，抑菌圈直徑達16 mm，培養(yǎng)時間為5 d時抑菌活性最強，抑菌圈直徑可達28.5 mm；隨著培養(yǎng)時間的增長，發(fā)酵液的抑菌活性逐漸降低，產生這種現(xiàn)象可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的消耗量增加而導致了菌株活性物質產量降低，同時活性產物的降解率提高所導致。因此，最佳培養(yǎng)時間選擇5 d（圖5-C）。

2.3.4接種量YH6發(fā)酵培養(yǎng)的接種量在1%～15%范圍內均有一定的抑菌活性，當接種量為8%時抑菌活性最強，抑菌圈直徑為27.6 mm，因此，YH6發(fā)酵培養(yǎng)過程中宜采用8%的接種量（圖5-D）。

2.3.5裝液量在裝液量為50 mL（250 mL的三角瓶中裝液50 mL）時，所得的發(fā)酵液具有較強的抑菌活性，隨著裝液量的逐漸增大，發(fā)酵液的抑菌活性則逐漸降低，這可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)過程中，三角瓶中的空氣含量減少影響了YH6產生活性物質的能力，說明該菌株在溶氧量較高的情況下容易產生活性物質。因此，培養(yǎng)的最佳裝液量為50 mL/250 mL（圖5-E）。

2.3.6轉速當轉速為120 r/min時抑菌活性最強，抑菌圈直徑達到27.5 mm，轉速過高或者過低都會影響菌株YH6活性物質的產生，產生這種現(xiàn)象可能是因為菌株YH6屬于好氧菌，對于好氧菌調節(jié)轉速可以達到增加溶氧量的目的，進而會提高活性物質的產量，但當轉速過高時，會對菌體的結構產生破壞從而抑制了活性物質的產生。因此，最佳發(fā)酵轉速選擇120 r/min（圖5-F）。

3結論與討論

通過單因素試驗和正交試驗相結合，初步得到了適合搖瓶條件下菌株YH6發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：甘薯粉8.0 g/L、硫酸銨 10.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、NaCl 2.0 g/L、CaCO3 1.0 g/L；最適培養(yǎng)條件為：初始pH值為8.0、發(fā)酵時間5 d、發(fā)酵溫度28 ℃、接種量8%、裝液量50 mL/250 mL，轉速為120 r/min。在此條件下，YH6的抑菌圈直徑高達29.8 mm，比在原始B培養(yǎng)基上抑菌圈25.3 mm 有了明顯提高。在優(yōu)化培養(yǎng)條件時，發(fā)現(xiàn)該菌株最適培養(yǎng)基pH值為8.0左右，表明該菌株喜歡在偏堿性的環(huán)境中生長，溫度在31 ℃以上時菌株抑菌活性顯著減弱，說明該菌株不耐高溫。

放線菌廣泛存在于自然界中，種類繁多，是一類有著很大應用潛力的微生物資源，從Cohn發(fā)現(xiàn)放線菌至今，有大量關于放線菌是重要的醫(yī)藥和農藥資源的報道。據(jù)報道，從海洋中分離獲得的具有抗菌活性的放線菌多為Streptomyces、Micromonospora、Pseudonocardia等[9-12]。

本試驗篩選出的來自大連海域的放線菌YH6對金黃色葡萄球菌具有很好的拮抗作用，經形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析將菌株YH6初步鑒定為球孢鏈霉菌。該菌株發(fā)酵液中活性代謝產物對大腸桿菌也有很好的抑制效果，因此具有較高的潛在價值。據(jù)報道，將該菌與其他菌種混合施入番茄幼苗可促進番茄地上部、地下部和整株鮮質量增加，根系活力增強和葉綠素含量提高[13]。此外，該菌對油菜菌核病有拮抗作用[14]，對甜瓜、棉花、草莓等作物常見土傳病害具有抑制作用[15]。因此，本試驗優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，為進一步分離純化其活性代謝產物以及開發(fā)高效生防制劑奠定基礎，期望在優(yōu)化其發(fā)酵工藝的基礎上進一步研究抑菌機

制及在食品、農產品防腐上的應用效果，從而有利于發(fā)揮其綠色保鮮功能。

參考文獻：

[1]高濤. 食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測方法的研究進展[J]. 福建分析測試，2003，12（2）：39-42.

[2]朱昌雄，謝德齡，倪楚芳. 農抗120防治西瓜枯萎病菌的室內藥效試驗[J]. 生物防治通報，1990，6（3）：124-127.

[3]蔣細良，謝德齡，倪楚芳，等. 中生菌素的抗生作用[J]. 植物病理學報，1997，27（2）：40-45.

[4]李曉虹，裴永娜，李學鋒，等. 幾株農用拮抗鏈霉菌的初步研究[J]. 微生物學雜志，2006，26（1）：26-28.

[5]姜健，楊寶靈，魯紅凱，等. 海洋微生物生物活性物質的研究[J]. 云南大學學報：自然科學版，2004，26（增刊1）：91-95.

[6]溫占波，裴月湖，田黎. 海洋微生物產抑真菌、抑腫瘤次生代謝產物的初步研究[J]. 中國海洋藥物，2003，22（6）：6-9.

[7]竇會娟，李林珂，劉新勝，等. 高抑制金黃色葡萄球菌活性放線菌的分離及分子鑒定[J]. 安徽農業(yè)科學，2011，39（9）：5076-5077.

[8]徐平，李文均，徐麗華，等. 微波法快速提取放線菌基因組DNA[J]. 微生物學通報，2003，30（4）：82-84.

[9]陳義光，張曉蓉，張麗，等. 具抗菌活性海洋放線菌菌株JMC 06001的分離和鑒定[J]. 微生物學通報，2008，35（1）：40-44.

[10]邵彥坡，方麗萍，魏少鵬，等. 海洋放線菌B5菌株發(fā)酵液抗菌譜及穩(wěn)定性研究[J]. 西北農業(yè)學報，2007，16（3）：248-251，256.

[11]劉姝，陸兆新，呂鳳霞，等. 一株海洋放線菌的分類鑒定及抗菌活性研究[J]. 南京農業(yè)大學學報，2007，30（4）：124-129.

[12]劉妍，李志勇. 海洋放線菌研究的新進展[J]. 生物技術通報，2005（6）：34-39.

[13]宋金枝. 放線菌不同施入方式對連作番茄幼苗生長的影響[J]. 西北農業(yè)學報，2014，23（2）：187-190.

[14]胡磊，牛世全，景彩虹，等. 拮抗油菜菌核病菌的鏈霉菌分離篩選與鑒定[J]. 中國油料作物學報，2013，35（1）：69-73.

[15]趙娟，薛泉宏，杜軍志，等. 廣譜拮抗放線菌C28的鑒定及其對甜瓜蔓枯病的防治效果[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2012，40（9）：65-71.蔣桂芳，宋力. 拮抗放線菌F2發(fā)酵液的穩(wěn)定性[J]. 江蘇農業(yè)科學，2015，43（9）：184-185，330.