侯紅，呂安林，達(dá)晶，侯兆蕾

(第四軍醫(yī)大學(xué)，西安市第二醫(yī)院，西安 710003)

1 引 言

心臟干細(xì)胞(Cardiac Stem Cells，CSCs)[1]是存在于心臟中具有自我復(fù)制、克隆形成、多向分化潛能的干細(xì)胞，具有顯著定向分化為心臟細(xì)胞系趨勢(shì)[2-4]。自體心臟干細(xì)胞移植治療不存在倫理問題、無免疫排斥反應(yīng)，具有更廣泛的臨床應(yīng)用前景，將成為治療心血管疾病理想的種子細(xì)胞。目前國內(nèi)外關(guān)于心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究較多，大多數(shù)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)方法不同誘導(dǎo)分化的效率也頗有差異[5-6]。本實(shí)驗(yàn)將研究5-氮雜胞苷(5-azacytidine, 5-AZ)和血管緊張素II(Angiopoietin-2, Ang II)分別及其聯(lián)合體外誘導(dǎo)人c-kit+CSCs向心肌細(xì)胞分化，通過Western Blotting檢測(cè)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞心肌特異性肌鈣蛋白I (Cardiac Troponin I ,cTn I)、 縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)的表達(dá)；用流式細(xì)胞儀對(duì)不同誘導(dǎo)方案心肌細(xì)胞分化率進(jìn)行分析，尋找提高誘導(dǎo)分化率的方案。

2 材料和方法

2.1 材料

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來自人右心耳組織經(jīng)酶消化、培養(yǎng)、流式分選純化的人心臟干細(xì)胞。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Ham’SF-12培養(yǎng)基(美國 Hyclone)；DMEM/F-12培養(yǎng)基(美國 Hyclone)；胎牛血清(FBS，美國 Hyclone)；Humanβ-FGF(美國PeproTech)；L-谷氨酰胺(美國Hyclone)；Ⅱ型膠原酶(美國MP)；0.05% 胰酶-0.02 mmol /L EDTA(美國Sigma)；PE 標(biāo)記 CD117(美國BioLegend)；鏈霉素(科昊生物試劑公司)；青霉素(科昊生物試劑公司)；5-氮雜胞苷(5-AZA)(美國Sigma)；血管緊張素 Ⅱ(Ang II)(美國Sigma)；RIPA裂解液(江蘇碧云天公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天公司)；BSA胎牛血清白蛋白(美國Sigma)；肌鈣蛋白I單抗(cTn I)(美國Abcam)；縫隙連接蛋白43(Cx43)(美國Abcam)；抗β-Tubulin兔多抗(北京康為世紀(jì)公司)；山羊抗兔、小鼠Ig G HRP(北京康為世紀(jì)公司)；山羊抗小鼠Ig G -FITC(北京康為世紀(jì)公司)；山羊抗兔 Ig G-Cy3(北京康為世紀(jì)公司)；5×蛋白上樣緩沖液(江蘇碧云天公司)；ECL顯影試劑盒(江蘇碧云天公司)；SDS-PAGE(晶彩生物公司)。

2.3 儀器

CO2細(xì)胞孵箱(HERA cell 150 德國 Thermo)，超凈工作臺(tái)(SW-OJ-1F 蘇凈集團(tuán)安泰公司)，低溫高速離心機(jī)(BiofugeStratos德國Thermo)，流式細(xì)胞儀(FACSAria美國BD)，高速離心機(jī)(BiofugeStratos)(德國Thermo)，超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore)，電熱恒溫水溫箱(SW2-261-79上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)，電泳儀(Power-Pzc)(美國Bio-RAD)，UVP分析核酸蛋白凝膠成像系統(tǒng)(VVP)(美國BioSpectrum)，轉(zhuǎn)膜儀(TRANS-BLOT)(美國Bio-RAD)。

3 方法

3.1 人心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化

選取無菌分選純化后融合90%左右的c-kit+CSCs進(jìn)行誘導(dǎo)、分化，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為四組：(1)對(duì)照組(Control組 心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液)，(2)5-AZA誘導(dǎo)組(10 μmol/L)，(3)Ang II誘導(dǎo)組(0.1 μmol/L)，(4)5-AZA和Ang II聯(lián)合誘導(dǎo)組(10 μmol/L +0.1 μmol/L)。對(duì)照組更換心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液；5-AZA、Ang II單獨(dú)誘導(dǎo)組誘導(dǎo)24 h后棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，更換心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液；5-AZA和Ang II聯(lián)合誘導(dǎo)組24 h后，棄去5-AZA誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，更換Ang II誘導(dǎo)培養(yǎng)液，24 h后PBS洗滌2次，更換心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液。誘導(dǎo)結(jié)束后，每隔2 d更換心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液1次，在含5 %CO2/95 %空氣的37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)4周。誘導(dǎo)4周后進(jìn)行各項(xiàng)測(cè)定。

3.2 人心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的測(cè)定

3.2.1誘導(dǎo)分化后心肌細(xì)胞特異蛋白cTn I、Cx43 Western Blot測(cè)定 收集誘導(dǎo)4周后各組細(xì)胞加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，12 000 rpm，4℃離心20 min。上清液1∶4加入5×蛋白上樣緩沖液混勻，100℃沸水煮10 min，冷卻后- 20℃保存?zhèn)溆?。配膠、上樣、電泳，溴酚藍(lán)指示條帶距離玻璃板下端1.0 cm時(shí)關(guān)閉電源開關(guān)停止電泳并轉(zhuǎn)膜。立春紅染色后5 %脫脂奶粉封閉。分別孵一抗(Cx43 1∶5000、cTn I 1∶2000、抗β-tublin 1∶4 000)，搖床4℃過夜。孵二抗： HRP標(biāo)記的山羊抗兔、小鼠Ig G二抗(1∶2 000)，室溫?fù)u床慢搖孵育1 h。加入顯影劑，放于凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像。

3.2.2誘導(dǎo)分化后心肌細(xì)胞分化率流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定 0.05 %胰酶-0.02 mmol /L EDTA 1 ml消化收集誘導(dǎo)4周的細(xì)胞。PBS洗滌調(diào)整細(xì)胞懸液密度約1 ×106個(gè)細(xì)胞 /ml，加入0.1 % TritonX-100室溫孵育，PBS洗滌重懸滴加cTn I抗體，37℃孵育1 h，再加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G，37℃避光孵育30 min，4 %多聚甲醛固定20 min。最后流式細(xì)胞儀測(cè)定各組FITC標(biāo)記陽性細(xì)胞的比例。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)的Tukey檢驗(yàn)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、P<0.01為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

5 結(jié)果

5.1 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞cTn I、Cx43的表達(dá)

誘導(dǎo)4周后用Western blotting 法測(cè)定各組細(xì)胞心肌特異性蛋白cTn I、Cx43的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：四組細(xì)胞均有cTn I、Cx43表達(dá)，對(duì)照組表達(dá)最弱，5-AZA和Ang II聯(lián)合組表達(dá)最強(qiáng)，5-AZA組表達(dá)高于Ang II組，Ang II組表達(dá)高于對(duì)照組，各組細(xì)胞中Cx43的表達(dá)量高于cTn I的表達(dá)(見圖 1 a)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析cTn I、Cx43表達(dá)量，結(jié)果顯示：5-AZA組、5-AZA和Ang II聯(lián)合組蛋白表達(dá)高于對(duì)照l組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.01)；5-AZA和Ang II聯(lián)合組蛋白表達(dá)高于Ang II組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.01)；5-AZA和 Ang II聯(lián)合組蛋白表達(dá)高于5-AZA組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；5-AZA組蛋白表達(dá)高于Ang II組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；Ang II組蛋白表達(dá)高于Control組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見圖 1b、c)。

5.2 誘導(dǎo)分化后心肌細(xì)胞分化率分析

采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞FITC標(biāo)記cTn I的表達(dá)，測(cè)定誘導(dǎo)4周后各組細(xì)胞心肌細(xì)胞分化率，分化率分別為：對(duì)照組37.1 %(見圖2a)、5-AZA組59.2 %(見圖2b)、Ang II組46.7%(見圖 2c)、5-AZA和Ang II聯(lián)合組68.6 %(見圖 2d)；各組細(xì)胞誘導(dǎo)分化率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：對(duì)照組(27.86±4.52)%、5-AZA組(52.71±7.40) % 、Ang II(40.48±7.02) %、5-AZA和Ang II聯(lián)合組(64.74±6.11)%；5-AZA組、5-AZA和Ang II聯(lián)合組心肌細(xì)胞分化率高于對(duì)照組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；5-AZA和 Ang II聯(lián)合組心肌細(xì)胞分化率高于Ang II組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；Ang II組心肌細(xì)胞分化率高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)； 5-AZA和 Ang II聯(lián)合組心肌細(xì)胞分化率高于5-AZA組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；5-AZA組心肌細(xì)胞分化率高于Ang II組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)(見圖 2e)。

圖1人c-kit+CSCs誘導(dǎo)4WcTnI、Cx43Westernblotting測(cè)定圖

Fig1ElectrophoresisofcTnIandCx43proteinineachgroupinducedhuman

誘導(dǎo)4周后各組細(xì)胞cTn I、Cx43 Western blotting測(cè)定，每組細(xì)胞都有cTn I和Cx43表達(dá)，5-AZA和Ang II聯(lián)合組表達(dá)最強(qiáng)，對(duì)照組表達(dá)最弱(a)；各組細(xì)胞cTn I、Cx43蛋白定量統(tǒng)計(jì)分析圖 (b、c)；**P<0.01 vs Control組；*P<0.05 vs Control組；#P<0.05 vs 5-AZA組；&&P<0.01 vs Ang II組。

6 討論

大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心臟干細(xì)胞可以改善缺血性心肌病的心功能[7-8]，是新興治療心血管疾病的種子細(xì)胞。但如無誘導(dǎo)分化因子(例如DMSO、BMP2、5-AZA)的存在,心肌干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的陽性率較低。5-AZA、Ang II是經(jīng)典的干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，多見于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞等向心肌細(xì)胞分化。5-AZA具有一定的細(xì)胞毒性，借鑒大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果及本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)1 d細(xì)胞死亡率明顯降低，同時(shí)誘導(dǎo)分化率較高，故本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)時(shí)間為1 d。近些年的研究顯示，5-AZA也可以誘導(dǎo)人CSCs向心肌細(xì)胞分化，相關(guān)機(jī)制不甚明確，可能機(jī)制為5-AZA是胞嘧啶核苷類似物，與DNA結(jié)合后具有抑制DNA甲基化作用，DNA去甲基化后可激活表型特異型基因[9]，激活肌細(xì)胞特異基因的表達(dá)[10]，如早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Nkx2.5基因表達(dá)[11-12]，促進(jìn)生肌調(diào)節(jié)因子MyoD的表達(dá)等，從而促進(jìn)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，也有研究表明Notch信號(hào)通路可能參與并發(fā)揮重要的作用[13-14]。Smits AM[15]和He Jiaqiang[16]等實(shí)驗(yàn)中5-AZA誘導(dǎo)人CSCs后心肌細(xì)胞分化率可高達(dá)70%左右，其原因可能是誘導(dǎo)時(shí)間不同，在相同誘導(dǎo)劑量的條件下，國外實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)時(shí)間多為3 d，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)時(shí)間為1 d，也可能是細(xì)胞種類相關(guān)，Smits AM在實(shí)驗(yàn)中用的是人Sca-1+CSCs。

圖2人c-kit+CSCs心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化率圖( %)

Fig2HistogramofcTnIandCx43proteinineachgroupinducedhumanCSCS

誘導(dǎo)4周各組心肌細(xì)分化率流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定，對(duì)照組37.1 %(a)、5-AZA組59.2 %(b)、Ang II46.7 %(c)、5-AZA和Ang II聯(lián)合組68.6%(d)；各組分化率統(tǒng)計(jì)分析(e)**P<0.01 vs 對(duì)照組；*P<0.05 vs 對(duì)照組；#P<0.05 vs 5-AZA組；&& P < 0.01 vs Ang II組。

Ang II是人體正常存在的一種多肽類激素，也是心肌細(xì)胞裂解液中的重要生物活性物質(zhì)，參與構(gòu)成心肌微環(huán)境，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。Ang II可誘導(dǎo)多種間充質(zhì)[17]及胚胎干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，相關(guān)機(jī)制尚不十分清楚，可能因?yàn)锳ng II與其受體結(jié)合后能活化多條信號(hào)通路，導(dǎo)致多種細(xì)胞活化[18]。Ang II可引起MAPK發(fā)生酪氨酸磷酸化活化ERK，通過激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[19]，活化的ERK1/2也可移位入核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，引起細(xì)胞增殖、分化[20]。Ang II也可促進(jìn)細(xì)胞β-TGF基因、β-TGF受體基因表達(dá)，從而通過PKA、PKC信號(hào)通路促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[21]。目前，Ang II在CSCs誘導(dǎo)分化中鮮見，近期研究顯示，CSCs細(xì)胞有Ang II受體[22]，Ang II與CSCs表面受體結(jié)合后可能通過上述相同的機(jī)制誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化。近期的研究顯示，Notch信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)Nkx2.5基因表達(dá)，可促進(jìn)CSCs向心肌細(xì)胞分化[23]，相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。5-AZA和Ang II聯(lián)合誘導(dǎo)人c-kit+CSCs分化為心肌細(xì)胞的分化率較高，其機(jī)制可能加強(qiáng)了某些共同的通路，也可能作用不同的獨(dú)立通路而起到協(xié)同作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探討。