黃棟，李韙韜，王紅珂，錢志余

(南京航空航天大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系，江蘇 南京 210016)

1 引 言

光動力療法( photodynamic therapy，PDT)是一種聯(lián)合利用光、光敏劑和氧分子，通過光動力反應(yīng)產(chǎn)生活性氧而選擇性地滅殺腫瘤的新方法，與手術(shù)、化療、放療等常規(guī)治療手段相比，是一種無創(chuàng)或微創(chuàng)、非產(chǎn)熱性的、利用光化學(xué)反應(yīng)引起靶組織和靶細(xì)胞破壞的治療方法[1]。近年來由于光敏物質(zhì)、光激活裝置以及導(dǎo)光系統(tǒng)的發(fā)展和進步，光動力學(xué)療法以其獨有的治療可控性已經(jīng)被用于治療食道、肺、胃、宮頸等惡性腫瘤，并取得令人滿意的效果[2]。然而大部分光敏劑(如血卟啉及血卟啉衍生物)的激發(fā)波長都在紫外/可見光區(qū)，對組織的穿透深度較淺，使PDT僅適用于激發(fā)光能照射到的體表或腔體等部位腫瘤、手術(shù)暴露部位腫瘤以及在影像技術(shù)引導(dǎo)下能將傳輸光纖插入到治療部位的腫瘤，很難直接用于深層腫瘤的治療中[3-6]；JessicaTyrell等利用非入侵式熒光成像監(jiān)測皮膚淺表光動力治療的有效性驗證[7]，Bradley J等設(shè)計了透明的氧傳感器連續(xù)監(jiān)測體外37℃緩沖恒溫器中的微血管活動中的氧含量[8]。本實驗室已經(jīng)成功合成了NaYF4:Yb,Er稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子，其發(fā)射上轉(zhuǎn)換熒光峰值波長在660 nm附近，與臨床常用的光敏劑鋅酞氰(ZnPc)結(jié)合，進行了初步的腫瘤光動力學(xué)治療研究。

現(xiàn)有的監(jiān)測手段和設(shè)備主要有針對淺表腫瘤的PDT，同時監(jiān)測參數(shù)單一，需要監(jiān)測多參數(shù)時，不僅需要操作多個軟件進行多種儀器的控制，而且記錄數(shù)據(jù)量大、操作復(fù)雜。本研究以LabVIEW為軟件開發(fā)平臺，將CCD微弱熒光成像、氧分壓采集、熒光強度采集、結(jié)果顯示、分析與存儲等多種功能融為一體，操作簡便，運行穩(wěn)定，實現(xiàn)了可用于深部腫瘤治療中氧分壓與微弱熒光綜合監(jiān)測成像系統(tǒng)。驗證實驗直接用660 nm激發(fā)光激發(fā)ZnPc與Luminol的混合液，監(jiān)測治療過程中的氧含量，以及具有腫瘤細(xì)胞殺傷作用的單態(tài)氧濃度，作為復(fù)合粒子進行光動力治療的參考。

2 系統(tǒng)設(shè)計與實現(xiàn)

2.1 硬件設(shè)計方案

硬件架構(gòu)見圖1。系統(tǒng)由一臺激光器、單色光路、樣品池、氧傳感器、熒光光纖探測器、CCD以及PC上位機組成。其工作過程是先由激光器發(fā)出660 nm的激發(fā)光，考慮到激發(fā)光是以660 nm為中心波長的一個寬波段的光，需經(jīng)由單色光路純化后，經(jīng)過T形擴束鏡均勻的照射到樣品池中。氧傳感器通過USB與上位機通信，可傳輸氧含量及溫度數(shù)據(jù)；插入在樣品池中的熒光光纖探頭，經(jīng)由光電倍增放大電路模塊處理，通過數(shù)據(jù)采集卡將熒光強度顯示在軟件中；借助CCD進行熒光拍照，定性觀察腫瘤大小隨治療過程的變化，圖像經(jīng)由USB數(shù)據(jù)線傳給上位機分析處理。

圖1 系統(tǒng)硬件架構(gòu)

系統(tǒng)硬件主要由三部分組成：氧分壓監(jiān)測模塊、微弱熒光監(jiān)測模塊以及微弱熒光成像模塊。系統(tǒng)選用海洋光學(xué)的光纖型氧傳感器NeoFox-FOXY。作為獨立的氧傳感器，其測試過程可有效抑制光纖形變及雜散光的干擾，相位噪聲較小，為保證測量結(jié)果的可靠性，使用前需進行兩點或多點校準(zhǔn)，且測量過程中要確保探針的穩(wěn)定性。

熒光強度是間接反映單態(tài)氧產(chǎn)率的重要指標(biāo)。利用實驗室自主設(shè)計的內(nèi)窺式聚焦光纖探頭作為微弱熒光采集前端，經(jīng)過光電倍增管，及后級放大電路經(jīng)由數(shù)據(jù)采集卡與上位機進行通信。光纖為春暉科技公司生產(chǎn)的石英光纖，其工作波長為200～1 200 um，光電倍增管為北京濱松公司的CR186型，其光譜響應(yīng)范圍為300～650 nm，峰值波長為420 nm。為了實時地觀測信號的變化情況，選取美國國家儀器公司的USB-6211高速數(shù)據(jù)采集卡進行數(shù)據(jù)采集，熒光成像選用普林斯頓高靈敏度相機PIXIS1024B_eXcelon進行熒光圖像的實時采集，其最大成像尺寸：1024×1024，像元：13 um×13 um，最低操作溫度為-70℃，特別適合低光照條件下成像。其集成的空氣制冷系統(tǒng)可保證實驗過程中長時間連續(xù)工作。

2.2 軟件整體設(shè)計

上位機控制軟件設(shè)計是整個氧分壓與微弱熒光監(jiān)測成像系統(tǒng)的核心，其主要功能模塊包括登錄界面、硬件連接檢測、圖像采集、單態(tài)氧濃度(熒光強度)采集、氧分壓與溫度采集以及圖像處理。本研究對軟件整體進行了性能分析與內(nèi)存優(yōu)化，實驗運行中穩(wěn)定流暢，上位機監(jiān)測系統(tǒng)的主程序流程見圖2。

2.3 軟件詳細(xì)設(shè)計

2.3.1CCD驅(qū)動與參數(shù)設(shè)置 利用PI公司提供的SITK開發(fā)包進行二次開發(fā)，實現(xiàn)了PIXIS1024B_eXcelon的驅(qū)動及參數(shù)設(shè)置。圖3箭頭所指的部分為設(shè)置的主要參數(shù)，包括曝光時間，默認(rèn)為0.008 ms；致冷溫度，為保證成像具有最小的噪聲干擾，通常設(shè)為-70℃；圖像幀數(shù)，即每次拍照采集圖像的個數(shù)以及觸發(fā)方式、定時方式、ADC速度的選擇。當(dāng)參數(shù)設(shè)置完畢，點擊初始化按鍵，初始化指示燈點亮，當(dāng)溫度計溫度達到設(shè)定的溫度值正負(fù)0.5范圍內(nèi)時，溫度指示燈點亮，表示已冷卻至指定溫度可進行圖像采集。程序運行流程為通過open toolkit& cam子vi獲得相機的設(shè)備ID，通過set temp和setup cam子vi設(shè)置相機初始冷卻溫度為-10℃以及快門開啟關(guān)閉時間，若相機打開成功會在while循環(huán)外的條件結(jié)構(gòu)里返回CCD的最大分辨率，并且將全局變量Camera Opened置為1。while循環(huán)中條件結(jié)構(gòu)內(nèi)依次通過set、trigger、ADC、Expmt、Init子vi完成初始化。為CCD驅(qū)動與參數(shù)設(shè)置程序框圖見圖3。

圖2系統(tǒng)軟件流程圖

Fig2Theflowtreeofsoftwaresystem

圖3 CCD驅(qū)動與參數(shù)設(shè)置LabVIEW程序圖

2.3.2微弱熒光監(jiān)測與成像 本部分實現(xiàn)了熒光數(shù)據(jù)采集與成像的并行工作。一方面利用NI提供的DAQm×9.3數(shù)據(jù)采集包編寫采集程序，初始化USB-6211數(shù)據(jù)采集卡后，程序自動將板卡信息添加到LabVIEW的DAQ采集控制中，前面板包括熒光數(shù)據(jù)采集設(shè)置部分，可選擇模擬輸入通道，設(shè)置采樣率，每通道采樣數(shù)以及采樣模式等。程序還包括兩個波形圖表進行數(shù)據(jù)實時觀測，一個顯示原始數(shù)據(jù)，一個顯示的是濾除50 Hz工頻噪聲后較穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，另可將采集的數(shù)據(jù)寫入測量文件，便于后續(xù)處理和分析。同時利用SITK開發(fā)包，實現(xiàn)了熒光圖像實時采集功能，考慮到NI自身的IMAQ開發(fā)包支持的圖像格式為BMPJPGTIFFGIFPNG，而SITK支持的圖片格式為SPEPMITIFF，為了保證成像質(zhì)量與兼容后續(xù)圖像處理功能，原始圖像格式設(shè)定為16bit Uint TIFF進行存儲，圖像分辨率可選1024×1024、512×512或自定義。

2.3.3氧分壓采集 本部分包括連接氧傳感器、氧含量數(shù)據(jù)曲線、數(shù)據(jù)存儲。借助海洋光學(xué)公司提供的動態(tài)鏈接庫NeoFox.dll及其說明文件，通過混合代碼編程技術(shù)，核心代碼通過CLN節(jié)點調(diào)用DLL中的函數(shù)來實現(xiàn)與氧傳感器的通信。通關(guān)for循環(huán)和條件結(jié)構(gòu)相結(jié)合，外層for循環(huán)最多支持8個氧傳感器同時工作，若檢索到hDecive不為0，則在外層條件結(jié)構(gòu)中判斷該氧傳感器是否有數(shù)據(jù)更新，若檢測到有更新，則進入最內(nèi)層條件結(jié)構(gòu)，依次獲得氧傳感器名字、溫度、氧分壓數(shù)據(jù)，關(guān)閉連接。數(shù)據(jù)存儲功能利用寫入測量文件(write to measurement file)可直接將采集數(shù)據(jù)保存為.lvm格式的文件，其功能與.txt文件類似。本氧分壓采集核心程序框圖見圖4。

圖4氧分壓采集程序框圖

Fig4TheLabVIEWprogramchartofpO2collection

2.3.4圖像處理模塊實現(xiàn)

(1)ROI分析

ROI即圖像的感興趣區(qū)域分析，實現(xiàn)圖像的在線處理及分析。其前面板左上部分為圖像選擇與保存及顏色選擇器，右上角為圖像顯示窗其功能包括縮放、線素分析、矩形、圓形、不規(guī)則區(qū)域分析，并且可以將圖像中的ROI區(qū)域一起保存。中間的Line Profile實時顯示線素長度及其對應(yīng)的像素值，Histogram實時顯示感興趣區(qū)域的直方圖數(shù)據(jù)。下方的Line Information及ROI Pixel Statistics表格分別記錄當(dāng)前及歷史分析的統(tǒng)計值、最大值、最小值、均值、標(biāo)準(zhǔn)差等并保存到系統(tǒng)默認(rèn)的文件中，便于后續(xù)整體分析。ROI分析前面板見圖5。

圖5 ROI分析前面板

(2)偽彩及疊加

本功能模塊基于MATLAB Script 節(jié)點實現(xiàn)了LabVIEW與MATLAB的無縫鏈接， 實現(xiàn)了偽彩、RGB至HSI色彩空間轉(zhuǎn)換、以及灰度圖與閾值圖疊加。偽彩基于常用的彩虹圖算法實現(xiàn)。RGB 和 HSI是二種最常用的顏色模型。RGB 模型基于三基色原理，面向硬件，便于顏色的采集和顯示；HSI 模型基于色調(diào)(Hue)-飽和度(Saturation)-亮度(Intensity)理論，符合人類觀察和感受顏色的視覺及心理學(xué)特點，便于從主觀出發(fā)對顏色進行操作。色彩空間轉(zhuǎn)換算法見表1。

表1 RGB至HSI色彩空間轉(zhuǎn)換

3 實驗及結(jié)果分析

3.1 實驗?zāi)康?/h3>

采集在660 nm激發(fā)光照射下，光動力反應(yīng)中單態(tài)氧濃度與氧含量變化以及熒光成像，為后續(xù)利用上轉(zhuǎn)換納米復(fù)合載藥粒子進行深部腫瘤治療過程中的參數(shù)監(jiān)測提供參考。

3.2 主要儀器與試劑

實驗儀器：連續(xù)激光器(中心波長66 0nm)、PIXIS1024B_eXcelon、含濾光片的光纖熒光處理系統(tǒng)、380～540 nm窄帶濾光片、氧傳感器、PC等。

實驗試劑：純凈水、峰值波長為450 nm碳量子點溶液(45 mg/mL)、不同濃度的魯米諾(Luminol)溶液、不同濃度的鋅酞氰(ZnPc)溶液。

3.3 Luminol與ZnPc熒光實驗

3.3.1實驗原理：采用660 nm的激發(fā)光照射溶液體系，ZnPc受激產(chǎn)生單態(tài)氧，單態(tài)氧可與Luminol反應(yīng)生成有機過氧化物，該過氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮氣，并生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長范圍為380～560 nm，中心波長為430 nm，位于可見光的藍光部分。

首先打開實驗系統(tǒng)，調(diào)節(jié)光電倍增管的外部電壓為1 000 V；其次用PBS溶液1 ml作參考，轉(zhuǎn)動激光器，調(diào)整到既可以激發(fā)溶液且打開關(guān)閉激光器對波形檢測無影響的位置，并固定好；其次將0.5 ml的500 uM Luminol溶液與0.5 ml的200 uM ZnPc溶液在黑暗環(huán)境中混合，有大量熱放出；將1 ml混合液調(diào)整到同樣狀態(tài)，之后打開激光器，同時將光纖和氧傳感器探頭插入到反應(yīng)體系中，分別采集熒光強度與氧分壓，并結(jié)合CCD采集熒光圖像，因為實驗系統(tǒng)對光較為敏感，為保證噪聲最小，整個實驗過程均在黑暗環(huán)境中進行。

圖6反應(yīng)體系微弱熒光曲線

Fig6Theweakfluorescencecurveofreactions

經(jīng)多次實驗結(jié)果可知：由圖6可知反應(yīng)體系中熒光較微弱，在660 nm激發(fā)光照射的條件下，40 s的幅值變化范圍在0.06～0.1 V左右，利用科學(xué)級CCD采集到的熒光圖像可以直觀的看到微弱熒光區(qū)域，鑒于CCD采集的為灰度圖像，為了方便觀察進行了偽彩處理，由圖7c中可以看到，兩種HSI偽彩方案較RGB偽彩有更好的抑制背景的能力；就氧分壓而言，大光斑照射下，反應(yīng)體系溶液中氧含量是充足的，圖8中向上的黑色箭頭為黑暗環(huán)境中測得的各部分的氧分壓，依次為在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下空氣中的氧分壓為20.7%，純凈水中氧分壓為30.6%，Luminol溶液中的氧分壓為26.3%， ZnPc溶液中氧分壓為17.7%；向下的黑色箭頭之后為在660 nm激發(fā)光照射的條件下，Luminol中氧含量為26.3%，將ZnPc溶液加入到Luminol中，氧含量會升高至54%，之后隨反應(yīng)進行會穩(wěn)定到30.9%左右，溶液體系是一個耗氧反應(yīng)，氧含量會影響治療效果。因此，通過監(jiān)測微弱熒光強度及氧含量，可為后續(xù)利用上轉(zhuǎn)換納米載藥復(fù)合粒子進行深部腫瘤的光動力治療提供定量的指導(dǎo)。

圖7反應(yīng)體系微弱熒光圖像

a分別為純凈水的原始圖、偽彩圖、疊加圖；b分別為反應(yīng)體系的原始圖、偽彩圖、疊加圖；c分別為反應(yīng)體系的RGB偽彩圖、坐標(biāo)變換法得到的HSI偽彩圖、幾何推導(dǎo)法得到的HSI偽彩圖

Fig7Theweakfluorescenceimageofreactions

圖8光動力反應(yīng)中氧分壓的變化曲線

Fig8ThepO2curveduringthePDT

4 結(jié)論

本研究利用圖形化編程語言LabVIEW，并結(jié)合PIXIS1024B_eXcelon、NeoFox、USB-6211構(gòu)造出一個實時的數(shù)據(jù)、圖像采集分析系統(tǒng)。在實驗環(huán)境應(yīng)用中證明，該系統(tǒng)能夠方便實驗人員實時監(jiān)測氧分壓及微弱熒光信號波形，以及微弱熒光成像，并能存儲數(shù)據(jù)并做進一步研究，程序具有良好的可靠性和擴展性。整個軟硬件系統(tǒng)集成度高、操作簡單、運行速度快、工作穩(wěn)定。對于PDT過程中熒光的強度、氧分壓與治療療效之間的對應(yīng)關(guān)系，還需要結(jié)合大量的小動物實驗、臨床實驗進一步分析。PDT過程中氧分壓及微弱熒光監(jiān)測成像系統(tǒng)，不僅對于研究深部腫瘤PDT治療監(jiān)測儀器的開發(fā)，具有一定的應(yīng)用價值，而且對于小動物成像、藥物分析等研究工作都有重要意義。