羅自生，秦 雨，徐艷群，徐庭巧，魏云瀟，何良興

（1.浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，浙江 杭州 310058；2.杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)中心，浙江 杭州 311199）

黃曲霉毒素的生物合成、代謝和毒性研究進(jìn)展

羅自生1，秦 雨1，徐艷群1，徐庭巧2，魏云瀟2，何良興2

（1.浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，浙江 杭州 310058；2.杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)中心，浙江 杭州 311199）

食品中黃曲霉毒素污染是最近關(guān)注的熱點(diǎn)，這些毒素侵染農(nóng)產(chǎn)品會(huì)帶來(lái)很大經(jīng)濟(jì)損失。黃曲霉毒素有非常高的肝毒性、肝致腫瘤性、致畸和致突變性，可在采前、采中和采后的各種環(huán)境下侵染多種重要農(nóng)產(chǎn)品，例如花生、玉米、水稻和棉籽。自然界中黃曲霉毒素的產(chǎn)生取決于多種因素，例如碳、氮、溫度、水分活度、pH值、發(fā)育階段、氧化脅迫、植物代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素可引起多種疾病，但是可以通過(guò)阻斷和干擾吸收及干擾代謝酶來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)的黃曲霉毒素。本文概述黃曲霉毒素的生物合成、侵染、運(yùn)輸、代謝和毒性。研究它的生物合成、毒性機(jī)制、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系和代謝運(yùn)輸途徑，為制定有效控制黃曲霉毒素的措施提供更加深入的見(jiàn)解。

黃曲霉毒素；生物合成；侵染；毒性；突變

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）包括大約20 種真菌代謝產(chǎn)物，可侵染多種食品，包括香料、谷物、無(wú)花果、堅(jiān)果和干果。盡管侵染大多發(fā)生在熱帶地區(qū)的糧食作物中，但與之相關(guān)的重要食品的國(guó)際貿(mào)易決定了黃曲霉毒素不僅是生產(chǎn)國(guó)家，也是進(jìn)口國(guó)家的難題。黃曲霉毒素主要是由黃曲霉（A. flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）產(chǎn)生的高毒性次生代謝產(chǎn)物。這些真菌在適宜的溫度和濕度條件下可以在多種食品和飼料中生長(zhǎng)，而且污染可以發(fā)生在從田間、采收、處理、輸送到貯藏的食品鏈的任何環(huán)節(jié)。黃曲霉毒素是一類二呋喃香豆素衍生物，其基本結(jié)構(gòu)中都有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?，在紫外光照射下可產(chǎn)生熒光。B族黃曲霉毒素連接戊酮，G族黃曲霉毒素連接的是六元內(nèi)酯，結(jié)晶的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）有較高的熱穩(wěn)定性［1］。AFB1對(duì)哺乳動(dòng)物毒性最大，會(huì)引起突變、致畸和肝損傷［2］。

黃曲霉毒素具有高毒性和致癌性，通過(guò)食物的直接消費(fèi)或者進(jìn)食黃曲霉毒素污染的飼料的動(dòng)物的間接消費(fèi)對(duì)人體起毒害作用。遺傳因素、生物和非生物因素影響黃曲霉毒素的形成，研究已經(jīng)揭示了參與黃曲霉毒素合成的每步反應(yīng)的酶的功能、編碼酶的基因及黃曲霉毒素形成代謝的調(diào)控機(jī)制。更好地了解調(diào)控黃曲霉毒素生物合成的基因?qū)?huì)幫助明確抑制真菌生長(zhǎng)和黃曲霉毒素產(chǎn)生的天然因素。遺傳和基因組資源將會(huì)顯著增強(qiáng)我們對(duì)黃曲霉毒素生物合成、霉菌的致病性以及霉菌作物的相互作用的理解。關(guān)于黃曲霉毒素生物合成基因的功能、基因調(diào)控和吸收代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新信息和其與環(huán)境介質(zhì)的相互作用已經(jīng)在深入研究。本文對(duì)黃曲霉毒素的合成、代謝、毒性以及干預(yù)方法作一綜述。

1　生物合成

黃曲霉毒素的生物合成是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，包含很多酶反應(yīng)。生物合成的起始階段類似于脂肪酸的生物合成，即乙酰CoA作為起始單位，丙二酸單酰CoA作為延長(zhǎng)單位，在聚酮化合物合成酶（polyketide synthase，PKSA）的催化下形成聚酮骨架［3］。黃曲霉毒素的生物合成途徑的認(rèn)知最初起源于對(duì)毒素結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。而在分子水平上，主要的生物化學(xué)步驟以及隨后的黃曲霉毒素生物合成的基因組分僅在過(guò)去10年才被揭示。黃曲霉和寄生曲霉的黃曲霉毒素合成基因顯著同源，簇上的基因排列是相同的［4］。Minto等［5］確定了黃曲霉毒素是由丙二酰輔酶A經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)合成的，第一步先產(chǎn)生己?；o酶A，第二步再形成一個(gè)蒽醌，整個(gè)過(guò)程至少需要18 個(gè)反應(yīng)步驟［6］。編碼酶的基因和轉(zhuǎn)錄因子位于黃曲霉和寄生曲霉基因組的一個(gè)大約70 kb大小的基因簇內(nèi)。其中每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄方向是唯一的［7］，同時(shí)黃曲霉和寄生曲霉的基因組結(jié)構(gòu)大體相同。Yabe等［8-9］提出了當(dāng)前被普遍接受的黃曲霉毒素生物合成模式：己酰輔酶A前體→諾素羅瑞尼克酸（NOR）→奧佛蘭提素（AVN）→奧佛路凡素（HAVN）→奧佛尼紅素（AVF）→羥基雜色酮（HVN）→雜色半縮醛乙酸（VHA）→雜色曲霉B（VER B）→雜色曲霉A（VER A）→柄曲霉素（DMST）→O-甲基柄曲霉素（ST）→黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素G1（AFG1）。

一般在真菌快速生長(zhǎng)停止以后，會(huì)產(chǎn)生由一種非核糖體肽合成酶催化合成的β-內(nèi)酰胺抗生素青霉素以及由聚酮途徑合成的聚酮黃曲霉毒素和雜色曲霉素，這些毒素是研究最透徹的幾種次生代謝產(chǎn)物［10］。次生代謝調(diào)控基因可以通過(guò)基因組計(jì)算機(jī)模擬分析很容易地進(jìn)行檢測(cè)［11］，次生代謝的調(diào)控基因是成簇的，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究黃曲霉毒素基因調(diào)控和進(jìn)化具有重要意義。

2　侵 染

很多農(nóng)產(chǎn)品易感染產(chǎn)黃曲霉毒素的霉菌。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）算全世界25%谷物因受真菌毒素污染而不能食用，其中受黃曲霉毒素污染最為嚴(yán)重［12］。主要農(nóng)作物如玉米、水稻和棉籽都被發(fā)現(xiàn)污染黃曲霉菌。熱帶和亞熱帶地區(qū)的食品和飼料中黃曲霉毒素的污染率相對(duì)來(lái)說(shuō)最高，濕熱的氣候?yàn)檎婢纳L(zhǎng)提供了適宜的條件［13］。農(nóng)作物中黃曲霉的生長(zhǎng)和黃曲霉毒素的產(chǎn)生受農(nóng)作物種類、真菌種類、作物中的水分含量、濕度、溫度和作物的物理傷害影響。黃曲霉毒素污染隨著作物受的脅迫和傷害程度增大而加重，包括采收前的干旱、昆蟲(chóng)活動(dòng)、收獲時(shí)間、采收和采后大雨和農(nóng)作物貯藏前未充分干燥。干燥和貯存過(guò)程中的濕度、溫度和通風(fēng)是其中最重要的影響因素。其中花生黃曲霉毒素侵染的主要途徑包括：1）花生栽培過(guò)程的農(nóng)業(yè)過(guò)程、害蟲(chóng)的危害、收獲前期的干旱脅迫以及不能適時(shí)采收；2）花生的收獲方式與晾曬干燥過(guò)程；3）莢果入貯時(shí)病、殘、破損和秕果數(shù)量越多，黃曲霉菌基數(shù)越大，貯藏過(guò)程中的莢果回潮、貯藏場(chǎng)所溫度、貯藏害蟲(chóng)的危害以及貯藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均會(huì)導(dǎo)致花生自身對(duì)黃曲霉菌的抵抗力下降［14］。

很多生物和非生物環(huán)境因素都會(huì)影響黃曲霉毒素的生物合成，包括例如碳源和氮源的營(yíng)養(yǎng)因素；例如水分活度和溫度的環(huán)境影響；例如pH值的生理?xiàng)l件和生物反應(yīng)劑［15］。許艷麗［16］研究證實(shí)通過(guò)改變貯藏環(huán)境條件來(lái)控制產(chǎn)毒菌的產(chǎn)毒是一個(gè)高效易行的方法；貯藏環(huán)境中的通風(fēng)條件、貯藏環(huán)境溫度和貯藏物的pH值對(duì)菌株的產(chǎn)毒影響巨大，較低的溫度和良好的通風(fēng)再加上弱堿性的pH值可很好地降低毒素的產(chǎn)量。Price等［17］研究了4 種因素對(duì)黃曲霉毒素通路特定基因轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)其影響最大，其次是pH值、氮源、碳源。

2.1碳源

碳源、氮源、氨基酸、脂類、微量元素和其他營(yíng)養(yǎng)因素早已被發(fā)現(xiàn)影響黃曲霉毒素的產(chǎn)生，其中最廣為人知的是碳源和氮源。碳源和黃曲霉毒素形成的關(guān)系已經(jīng)明確，單糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖和麥芽糖有利于黃曲霉毒素的形成，而蛋白胨、山梨糖和乳糖則起到抑制作用。Woloshuk等［18］報(bào)道了α-淀粉酶的活性與黃曲霉黃曲霉毒素的產(chǎn)生之間的聯(lián)系。李紅波等［19］研究了香菇多糖、海帶多糖、石耳素等10余種多糖對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的抑制作用，發(fā)現(xiàn)海帶多糖、香菇纖維素、馬鈴薯直鏈淀粉、A型大豆多糖能夠明顯降低黃曲霉菌絲產(chǎn)量；同時(shí)海帶多糖、香菇纖維素、馬鈴薯纖維素、香菇多糖、綠豆多糖抑制了黃曲霉產(chǎn)毒。

Yu等［20］確定了寄生曲霉菌中比鄰黃曲霉毒素基因簇的一 個(gè)和糖利用有關(guān)的基因簇。這兩個(gè)基因簇之間緊密的物理聯(lián)系可以證明在碳水化合物誘導(dǎo)黃曲霉毒素合成過(guò)程中兩個(gè)基因簇的關(guān)系。脂質(zhì)底物是有利于黃曲霉毒素產(chǎn)生的良好碳源。脂肪酶基因（LipA）在黃曲霉和寄生曲霉中克隆表達(dá)。脂質(zhì)底物可以誘發(fā)LipA的表達(dá)和隨后黃曲霉毒素的產(chǎn)生。向不利于黃曲霉毒素生長(zhǎng)的蛋白胨培養(yǎng)基中添加0.5%的豆油可誘導(dǎo)酶基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致黃曲霉毒素的形成。然而，碳源參與黃曲霉毒素的代謝通路基因表達(dá)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.2氮源

真菌可以利用各種氮源，氮和黃曲霉毒素的產(chǎn)生緊密相連。還原態(tài)氮源促進(jìn)黃曲霉毒素的合成，氧化態(tài)氮源抑制。天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、硝酸銨、亞硝酸銨、硫酸銨、谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸都有利于黃曲霉毒素產(chǎn)生；而硝酸鈉和亞硝酸鈉不利于黃曲霉毒素形成。硝酸鹽對(duì)黃曲霉毒素的產(chǎn)生有抑制作用，而由aflR額外副本造成的aflR基因的過(guò)度表達(dá)抑制了對(duì)黃曲霉毒素通路基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)作用。不同氨基酸對(duì)黃曲霉毒素的產(chǎn)生有不同的影響。最近的研究表明色氨酸阻止黃曲霉毒素的產(chǎn)生，而酪氨酸增加黃曲霉中黃曲霉毒素的產(chǎn)生［21］。

2.3溫度

黃曲霉毒素的形成受溫度的直接影響，寄生曲霉生長(zhǎng)的最小溫度范圍是6～8 ℃，最大是44～46 ℃，最佳溫度是25～35 ℃。黃曲霉毒素在12～34 ℃的溫度范圍產(chǎn)生，在36 ℃時(shí)產(chǎn)毒停止，最適產(chǎn)毒溫度為28～30 ℃。黃曲霉毒素的產(chǎn)生由溫度調(diào)控，因?yàn)楫?dāng)溫度由34 ℃提高到37 ℃時(shí)，黃曲霉毒素大量減少。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）測(cè)定aflR、反義aflR、aflS和aflP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所有這些基因的水平相對(duì)測(cè)試溫度而變化。由非生物因素施加的輕度脅迫引發(fā)黃曲霉毒素的產(chǎn)生；但低于強(qiáng)度脅迫條件（水分活度0.9，溫度大于37 ℃），盡管誘導(dǎo)了整個(gè)黃曲霉毒素生物合成基因簇，黃曲霉毒素合成卻受到抑制。使用基因芯片和反轉(zhuǎn)錄PCR全基因組基因表達(dá)譜表明高溫和黃曲霉毒素通路基因表達(dá)減少有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)出控制基因aflR和aflS（aflJ）豐富數(shù)量的副本［22］，其中aflR對(duì)黃曲霉毒素的生物合成在轉(zhuǎn)錄水平上起調(diào)節(jié)作用，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄依賴于aflR基因的轉(zhuǎn)錄，aflR基因的過(guò)度表達(dá)，使黃曲霉毒素合成的量增多。有人推測(cè)，溫度影響afl R的活性或者其他未知的調(diào)控因素。

2.4水分活度

李瑞芳等［23］研究發(fā)現(xiàn)，水分活度是影響黃曲霉生長(zhǎng)的重要因素，水分活度低于0.90就不能生長(zhǎng)，水分活度越高越有利于霉菌生長(zhǎng)和毒素合成。研究記錄顯示，玉米中嚴(yán)重的黃曲霉毒素的爆發(fā)多發(fā)生在炎熱和干旱條件下［24］。此狀況下玉米污染黃曲霉毒素的機(jī)理還不是很清楚，可能的原因包括這些：1）在水分脅迫條件下，植物的防御機(jī)制減弱；2）昆蟲(chóng)侵食和相關(guān)的植物組織受傷為真菌入侵提供了機(jī)會(huì)；3）干燥氣候下，更多的真菌孢子散布到空氣中［25-26］。

2.5pH值

黃曲霉毒素的生物合成發(fā)生在酸性介質(zhì)中，在堿性介質(zhì)中被抑制。黃曲霉毒素合成的最佳酸堿度為pH值在3.4～5.5范圍內(nèi)。PacC基因是pH值平衡的一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在aflR啟動(dòng)子區(qū)域，至少確定了一個(gè)PacC結(jié)合位點(diǎn)。PacC在堿性條件下特定水解以后功能活躍。PacC蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與啟動(dòng)子DNA結(jié)合，導(dǎo)致堿性pH值表達(dá)基因的誘導(dǎo)和酸性pH值表達(dá)基因的抑制。在不利于黃曲霉毒素的蛋白胨培養(yǎng)基中，表明此位點(diǎn)抑制黃曲霉毒素的形成。此控制機(jī)理或許是在堿性條件下PacC結(jié)合位點(diǎn)抑制酸表達(dá)基因aflR，進(jìn)而抑制黃曲霉毒素的形成［27］。

2.6發(fā)育階段

產(chǎn)孢和菌核的形成與次生代謝有關(guān)［28］。孢子形成和次生代謝產(chǎn)物的形成發(fā)生在大約相同的時(shí)間。一些缺乏孢子的突變體不能產(chǎn)生黃曲霉毒素，抑制寄生曲霉產(chǎn)孢的一些化合物也可以抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生。經(jīng)過(guò)一系列傳代培養(yǎng)產(chǎn)黃曲霉毒素能力逐漸下降。黃曲霉毒素生成變化伴隨著顯著的形態(tài)學(xué)變化［29］。

此外，抑制寄生曲霉和構(gòu)巢曲霉中多胺生物合成的化學(xué)品抑制孢子和黃曲霉毒素或甲基柄曲霉素（sterigmatocystine，ST）的生物合成。更近的研究表明孢子和甲基柄曲霉素產(chǎn)生的控制是通過(guò)構(gòu)巢曲霉信號(hào)通路介導(dǎo)的一個(gè)共享的G-蛋白進(jìn)行的［26］。黃曲霉毒素產(chǎn)生調(diào)控中涉及FadA的G-蛋白信號(hào)通路也存在于黃曲霉和寄生曲霉中。

2.7氧化脅迫

寄生曲霉中氧化脅迫和黃曲霉毒素生物合成是相關(guān)的［30］。氧化脅迫誘導(dǎo)寄生曲霉中黃曲霉毒素的形成。對(duì)黃曲霉用叔丁基過(guò)氧化氫或者沒(méi)食子酸處理，黃曲霉毒素顯著增加［31］。對(duì)寄生曲霉同樣處理也會(huì)誘導(dǎo)黃曲霉毒素產(chǎn)生［30］。水解單寧顯著抑制黃曲霉毒素生物合成，其中主要的抗黃曲霉毒素成分主要是沒(méi)食子酸。沒(méi)食子酸減少黃曲霉毒素生物合成基因簇中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，但不是黃曲霉毒素通路基因調(diào)控者afl R，沒(méi)食子酸擾亂了黃曲霉毒素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。某些酚類或者抗氧化 劑，例如抗壞血酸，加到氧化脅迫的黃曲霉中，黃曲霉毒素的產(chǎn)生顯著下降［31］?？Х人崾橇硪环N抑制黃曲霉毒素的抗氧化劑。用咖啡酸處理的黃曲霉微陣列分析發(fā)現(xiàn)了一種基因叫ahpC2，表達(dá)為一種潛在參與平息黃曲霉毒素合成信號(hào)的烷基過(guò)氧化氫還原酶。

2.8植物代謝產(chǎn)物

植物代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉毒素的形成起到一定作用。Wright等［32］報(bào)道稱，在一定條件下與對(duì)照組相比，正癸醛不僅抑制寄生真菌生長(zhǎng)，也減少超過(guò)95%的黃曲霉毒素產(chǎn)生。辛醛抑制60%的真菌生長(zhǎng)，而黃曲霉毒素的產(chǎn)生增加500%。脂氧合酶的反應(yīng)產(chǎn)物13（S）-過(guò)氧化氫的衍生物亞油酸會(huì)減少黃曲霉毒素的產(chǎn)生［33］。研究證實(shí)葉綠素的半合成水溶性衍生物——葉綠酸能通過(guò)阻斷致癌物的生物活性而有效抑制黃曲霉毒素誘導(dǎo)動(dòng)物肝癌的發(fā)生。例如來(lái)自棉葉和玉米葉的揮發(fā)性醛類和其他植物化學(xué)物能影響黃曲霉生長(zhǎng)和黃曲霉毒素的合成，五倍子酸抑制其生物合成［34］。因此，除了常規(guī)檢測(cè)和篩查，黃曲霉毒素污染管理必須采取包括采前和采后控制措施。

3　黃曲霉毒素的運(yùn)輸與代謝

3.1囊泡理論與黃曲霉毒素的合成運(yùn)輸

囊泡和液泡中存在大量合成次生代謝產(chǎn)物的酶，但其在次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素代謝過(guò)程中的作用并不清楚。直到Chanda等［35］提出了黃曲霉區(qū)域化、毒素基因表達(dá)、碳源途徑的調(diào)控模型（圖1），其分為兩部分，1）區(qū)域化：Nor-1、Ver-1和OmtA在細(xì)胞質(zhì)游離核糖體合成，包裝成運(yùn)輸小泡，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)到液泡的靶向（CvT）路徑運(yùn)送到液泡。2）基因控制：感測(cè)到葡萄糖濃度和葡萄糖代謝啟動(dòng)FadA/cAMP/PKA信號(hào)通路。線粒體和過(guò)氧化物酶體提供乙酰CoA合成聚酮化合物。過(guò)氧化物酶體中黃曲霉毒素合成中的早期步驟的發(fā)生（乙酰CoA到諾素羅瑞尼克酸）已由其他人提出。目前研究指出了在黃曲霉毒素囊泡中后期途徑酶的作用，囊泡也參與黃曲霉毒素釋放。至少兩種單獨(dú)的信號(hào)（碳源和光照）觸發(fā)VeA的活性，協(xié)調(diào)控制參與黃曲霉毒素合成運(yùn)輸?shù)膬刹糠?。一部分通過(guò)激活一般或特定轉(zhuǎn)錄因子提高基因轉(zhuǎn)錄。另一部分降低限制復(fù)合物（Tc）活性，導(dǎo)致運(yùn)輸小泡的積聚。當(dāng)兩部分運(yùn)行時(shí)，黃曲霉毒素酶在囊泡積聚，進(jìn)行黃曲霉毒素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)毒素到細(xì)胞外。

圖1　黃曲霉區(qū)域化、毒素基因表達(dá)、碳源途徑的調(diào)控［3355］Fig.1 Regulation of subcellular compartmentalization， aflatoxin gene expression and carbon flow［3355］

Chanda等［36］隨后又提出了囊泡化合成釋放激素的理論模型（圖2）。由于VeA介導(dǎo)的限制復(fù)合物（Tc）活性下調(diào)黃曲霉毒素囊泡出現(xiàn)。在黃曲霉毒素囊泡合成的黃曲霉毒素理論上可以通過(guò)一種或更多的機(jī)制被釋放到細(xì)胞外：穿梭（黃曲霉毒素囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)物穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜），泵（當(dāng)囊泡黏附到細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)表面時(shí)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［Tp］蛋白介導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的釋放）和破裂釋放機(jī)制（囊泡伸出細(xì)胞表面，將毒素釋放到介質(zhì)中）。研究證實(shí)囊泡數(shù)量增加與AFB1的累積或輸出正相關(guān)，AFB1在囊泡中完成催化合成，轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，當(dāng)囊泡與液泡融合時(shí)，合成明顯減少。

他們開(kāi)始用晚齋了，了空法師吃完之后，用清水沖了一下木碗，將湯湯汁汁全融入清水中，再喝下去，風(fēng)影也學(xué)著師父的樣子做了一遍。了空法師再次提出明天就要離開(kāi)白云寺，到遠(yuǎn)方去云游，他問(wèn)風(fēng)影是否愿意一道同去。風(fēng)影怔了怔，一本正經(jīng)地說(shuō)，師父，你不是說(shuō)不要隨便下山，山下有老虎嗎？天下有那么多女人，到處都是老虎，你就不怕被吃了？了空法師笑道，你若不想去就算了，用不著這么邪乎的。風(fēng)影摸了摸自己光光的頭皮，也情不自禁地笑了。

圖2　囊泡化合成釋放激素的理論模型［3366］Fig.2 Theoretical model of vesicle synthesis and hormone release［3366］

總之，絲狀真菌寄生曲霉進(jìn)化出高度保守的囊泡運(yùn)輸機(jī)制來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)到達(dá)液泡，同時(shí)此機(jī)制還可以完成新的細(xì)胞功能，即黃曲霉毒素的合成、區(qū)域化和轉(zhuǎn)運(yùn)。黃曲霉毒素在特定的囊泡合成即黃曲霉毒素誘導(dǎo)條件下囊泡-空泡部位將雜色曲霉毒素，在黃曲霉毒素合成的后中間體，轉(zhuǎn)化為AFB1。這些亞細(xì)胞器在區(qū)域化和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中也起重要作用。囊泡和胞漿膜融合發(fā)生胞吐作用來(lái)促進(jìn)黃曲霉毒素釋放到生長(zhǎng)介質(zhì)中。

3.2黃曲霉毒素的代謝

攝入AFB1后，經(jīng)P450氧化酶CYP450家族成員代謝轉(zhuǎn)化為AFM1、AFP1、AFQ1和黃曲霉毒素醇等，前三者均無(wú)活性，經(jīng)尿液直接排出或與葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合經(jīng)糞便排出；黃曲霉毒素醇又可被氧化成AFB1［37］。肝微粒體細(xì)胞色素P450將黃曲霉毒素代謝為親電的活性環(huán)氧化物，然后結(jié)合到DNA和其他關(guān)鍵的細(xì)胞大分子上。黃曲霉毒素是“致癌原”，酶法生物活化是其致癌作用的前提條件。其毒性很可能是由肝臟中由細(xì)胞色素P450在AFB1代謝過(guò)程中通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧而產(chǎn)生的，即超氧陰離子、羥自由基和過(guò)氧化氫。這類物質(zhì)可攻擊可溶性細(xì)胞物質(zhì)和膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能的損害和細(xì)胞溶解。小腸吸收以后，AFB1容易結(jié)合血漿白蛋白，在血液中充當(dāng)黃曲霉毒素的主要輸送者［38］。在肝臟中，AFB1被微粒體多功能氧化酶（細(xì)胞色素P450）氧化成一些水溶性代謝產(chǎn)物。

活性代謝物AFB1-8，9環(huán)氧化合物的形成及其隨后與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合，在急性和慢性中毒中起關(guān)鍵作用［39］。此環(huán)氧化合物并不一定產(chǎn)生遺傳毒性和細(xì)胞毒性損害，因?yàn)樗梢杂森h(huán)氧化物水解酶（EPHx）催化形成AFB1二氫二醇失去和DNA結(jié)合的位點(diǎn)而失活［40］，或者在谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）的作用下最終以AFB1-硫醇尿酸（AFB1-mercaptutic acid，AFB1-NAC）經(jīng)尿液排出。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是最重要的AFB1去毒酶，有些動(dòng)物對(duì)AFB1極其敏感，例如火雞，或許是由于它細(xì)胞色素P450高效活動(dòng)以及肝臟缺乏AFB1特定的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶而去毒不足綜合造成的［41］。

另有一部分AFB1-8，9-環(huán)氧化物與血清白蛋白結(jié)合形成AFB1-白蛋白加合物而殘留于血液中，其主要形式為AFB1-賴氨酸加合物，即與蛋白質(zhì)賴氨酸的ε-氨基共價(jià)結(jié)合。還有一部分AFB1的環(huán)氧化物與DNA中的鳥(niǎo)嘌呤反應(yīng)，即AFB1-8，9-環(huán)氧化物的第8位碳原子與鳥(niǎo)嘌呤的第7位氮原子共價(jià)結(jié)合形成AFB1-N7-鳥(niǎo)嘌呤加合物，肝內(nèi)形成的大部分此加合物經(jīng)DNA修復(fù)可較快清除，另有一部分轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)環(huán)的AFB1-甲酰氨基嘧啶加合物進(jìn)入血液并經(jīng)尿液排泄［42］。AFB1的環(huán)氧化物可以與鳥(niǎo)嘌呤殘基反應(yīng)，AFB1-N7-鳥(niǎo)嘌呤加合物量多、生物學(xué)效應(yīng)強(qiáng)，它帶正電荷的咪唑環(huán)能引起后續(xù)脫嘌呤，形成無(wú)嘌呤嘧啶位點(diǎn)，或者形成咪唑環(huán)形成更加穩(wěn)定的AFB1-甲酰胺加合物，其可能是AFB1發(fā)揮毒性作用的主要形式之一［43］。

4　黃曲霉毒素的毒性

應(yīng)用于人類接觸黃曲霉毒素和生物效應(yīng)的生物標(biāo)志物的發(fā)展是理解代謝、DNA加合物感應(yīng)、致突變性和致癌的基礎(chǔ)［44］。黃曲霉毒素是霉菌毒素中研究最深入的一類，原因是其對(duì)家畜和脆弱的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌性和毒理作用及對(duì)人類的急慢性肝腫瘤和毒理作用。黃曲霉毒素的LD50（半數(shù)動(dòng)物致死量）為0.249 mg/kg，其毒性是氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍，能引起急性中毒死亡［45］。

AFB1的致癌和致突變效應(yīng)或許是親電、高活性AFBO對(duì)像DNA的細(xì)胞親核試劑親和。因此，環(huán)氧化被普遍認(rèn)為代謝物激活，而羥基化、水合和去甲基化被認(rèn)為是代謝去毒［46］。小鼠肝臟中參與AFB1激活的CYP1A1、CYP2B1/2和CYP2C11已經(jīng)被研究。一些CYP被奧替普拉（OPZ）［5-（2-吡嗪）-4-甲基-1，2-二硫雜環(huán)-3-硫酮］誘導(dǎo)致癌物解毒酶。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、環(huán)氧化物酶、NADP（H）醌還原酶和尿嘧啶核苷5’-二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶參與對(duì)一些致癌物解毒。OPZ既是CYP的抑制劑又是誘導(dǎo)劑，CYP參與老鼠中AFB1激活。來(lái)自不同CYP的蛋白代謝AFB1成為致突變產(chǎn)物和致癌物AFBO。AFB1誘導(dǎo)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的形成，導(dǎo)致DNA堿基的氧化，誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

4.1黃曲霉毒素與癌癥和肝炎

［47］。慢性乙肝病毒感染和接觸濃度高的膳食黃曲霉毒素對(duì)肝癌來(lái)說(shuō)是兩個(gè)主要的誘發(fā)因素。環(huán)境接觸黃曲霉毒素的致癌作用增加了乙肝病毒表面抗原（HBsAg）攜帶者患肝癌的危險(xiǎn)。但還需要大規(guī)模的研究來(lái)評(píng)價(jià)接觸黃曲霉毒素對(duì)乙肝病毒表面抗原攜帶者的影響。由霉菌產(chǎn)生的致癌性毒素（黃曲霉毒素）與乙肝病毒協(xié)同互動(dòng)增大了人類患HCC的風(fēng)險(xiǎn)［48］。

AFB1是一種很強(qiáng)的肝毒素和肝致癌劑，肝臟被認(rèn)為是黃曲霉毒素首要的目標(biāo)［49］。黃曲霉毒素有毒代謝產(chǎn)物與對(duì)細(xì)胞活力至關(guān)重要的核酸、核蛋白結(jié)合，最終導(dǎo)致肝脂質(zhì)過(guò)度積聚、肝臟腫大、膽管上皮增生、壞疽和肝癌。AFB1必須由細(xì)胞色素P450酶轉(zhuǎn)化成反應(yīng)中間體AFB1-8，9環(huán)氧化合物來(lái)發(fā)揮它的致肝腫瘤作用［50］。

黃曲霉毒素和HBV協(xié)同致癌，HBV本身不會(huì)引起DNA損傷和肝細(xì)胞癌變，DNA修復(fù)系統(tǒng)可使AFB1-DNA加合物引起的DNA損傷獲得及時(shí)修復(fù)，降低黃曲霉毒素引起的致癌效應(yīng)。HBV蛋白影響宿主DNA修復(fù)系統(tǒng)和藥物代謝酶系統(tǒng)，抑制受損DNA的修復(fù)。病毒造成潛在缺陷使AFB1及其代謝產(chǎn)物一旦攻擊DNA，受損DNA累積造成肝癌發(fā)生率增加。另外，AFB1的攻擊還降低了細(xì)胞色素P450代謝酶基因的表達(dá)，增加AFB1及其代謝產(chǎn)物的致癌效應(yīng)［51］。AFB1及其代謝產(chǎn)物致癌的分子機(jī)制主要是癌基因的激活和抑癌基因的失活。有研究表明AFB1及其代謝產(chǎn)物引起了癌基因（如ras、c-fos）及抑癌基因（如p53）表達(dá)的改變。

4.2黃曲霉毒素與變異

黃曲霉毒素引起變異，能使人成纖維細(xì)胞發(fā)生程序外DNA合成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)染色體畸變、染色體斷裂及某些染色體缺失。黃曲霉毒素誘發(fā)DNA損傷和基因突變。小孩通常比成年人更容易受毒性物質(zhì)影響，包括對(duì)遺傳毒性致癌物的敏感性增加。已經(jīng)證實(shí)，成年老鼠比起新生老鼠不容易受直接烷化劑N-乙基-N-亞硝胺和芳香胺4-氨基聯(lián)苯的誘變效應(yīng)影響。黃曲霉毒素致 突變的作用主要是通過(guò)與DNA、RNA和蛋白質(zhì)形成加合物而實(shí)現(xiàn)，同時(shí)它也會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用和DNA氧化損傷［52］。黃曲霉毒素被攝入后主要經(jīng)過(guò)肝臟的細(xì)胞色素P450組酶代謝，轉(zhuǎn)換成很多代謝產(chǎn)物，其中有一種就是AFT-8，9環(huán)氧化合物。AFB1-8，9環(huán)氧化合物可以與DNA共價(jià)結(jié)合形成加合物，這種加合物是黃曲霉毒素產(chǎn)生生物效應(yīng)的原因，即導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的失控［53］。AFBO極易與DNA鏈上鳥(niǎo)苷殘基上的N7共價(jià)結(jié)合，它 們之間的電子云因原子核的吸電子作用而漂移，自發(fā)形成其他DNA損傷形式，包括DNA加合物引起的堿基修飾、形成無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶位點(diǎn)、DNA單鏈和雙鏈損傷、DNA氧化性損傷、DNA堿基錯(cuò)配損傷及能引起姐妹染色體交換（sister-chromatid exchange，SCE）頻率增加，增加基因的不穩(wěn)定性［51］。

4.3黃曲霉毒素與生殖

黃曲霉毒素對(duì)健康有很多不利影響，但對(duì)于它如何影響生殖系統(tǒng)及它對(duì)生殖健康的危害還沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論［54］。不孕不育的原因有很多，例如性病、蟲(chóng)疾、生理與遺傳缺陷。其中了解最少的是有毒物質(zhì)的影響，包括霉菌毒素［55］。黃曲霉毒素通過(guò)影響性成熟、卵泡的生長(zhǎng)和成熟、激素水平、妊娠和胎兒的發(fā)育影響生殖［56］。精液帶有高濃度黃曲霉毒素的不育男性中有50%的人的精子異常（精子密度、形態(tài)學(xué)、蠕動(dòng)）。黃曲霉毒素降低生殖能力，提高胚胎死亡率。血激素水平和性器官受黃曲霉毒素嚴(yán)重影響，AFB1擾亂了受感染動(dòng)物體的荷爾蒙平衡。

5　黃曲霉毒素吸收和代謝的干預(yù)

一旦攝入黃曲霉毒素，可以通過(guò)兩種途徑降低體內(nèi)黃曲霉毒素的毒性和致癌性。

5.1阻斷和減少黃曲霉毒素的吸收

益生菌可以吸附黃曲霉毒素，形成菌體-AFT復(fù)合體，使得黃曲霉毒素在腸道的吸收減少，微生物和黃曲霉毒素一起排出。腐殖酸是一種有機(jī)高分子化合物，對(duì)重金屬、芳香族化合物、礦物質(zhì)等吸附作用強(qiáng)，有研究表明，從煙煤中提取的腐殖酸對(duì)AFB1有較強(qiáng)吸附作用。葉綠酸與AFB1結(jié)合成牢固的分子化合物，影響AFB1的吸收，降低攝入的致癌物的生物活性［57］。研究表明，葡甘聚糖及其與無(wú)機(jī)吸附劑組成的復(fù)合物在常溫下對(duì)黃曲霉毒素的吸附效果均比較好，其機(jī)制是甘露低聚糖可通過(guò)氫鍵、離子鍵和疏水作用力對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生吸附力，其以物理作用為主［58］。

5.2干預(yù)藥物代謝酶調(diào)節(jié)黃曲霉毒素在體內(nèi)的代謝

研究發(fā)現(xiàn)許多中藥及其有效成分可作用于藥物代謝酶系統(tǒng)，進(jìn)而影響黃曲霉毒素的代謝活化及解毒，例如黃岑、丹參、姜黃素、黃酮、多酚等。吡噻硫酮抗黃曲霉毒素的機(jī)制是不但減少AFB1-8，9-環(huán)氧化合物，而且提高GST的活性，促進(jìn)谷胱甘肽與AFB1-8，9-環(huán)氧化合物結(jié)合，增加AFB1-硫醇尿酸加合物經(jīng)尿液排出。曹驥等［59］研究發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)AFB1和HBV誘發(fā)的樹(shù)鼩肝癌有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是誘導(dǎo)體內(nèi)GST促進(jìn)致癌物的解毒，抗氧化作用、提高免疫功能、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。例如水果蔬菜中的香豆素、芐基異硫氰酸酯和3-羥甲基吲哚的植物性化合物，可抑制AFB1誘導(dǎo)的肝癌。Lee等［60］研究發(fā)現(xiàn)蔥白的提取物能有效減輕肝癌細(xì)胞中AFB1所致的過(guò)氧化損傷，從而減輕AFB1所致的細(xì)胞毒性和DNA損傷，其作用機(jī)制主要是降低細(xì)胞色素氧化酶CYP450家族成員CYP3A4的活性，提高GST的活性，預(yù)防癌癥。另外還有一些抗氧化劑、β-胡蘿卜素、蕪菁汁等也可干預(yù)黃曲霉毒素在體內(nèi)的代謝。有研究表明，硒對(duì)動(dòng)物AFB1中毒有緩解作用，其機(jī)制是通過(guò)影響AFB1在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，如細(xì)胞色素P450和GST等的活性，緩解動(dòng)物的中毒現(xiàn)象［61］。梁雅婷［62］發(fā)現(xiàn)亞麻酸氧化衍生物抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生和黃曲霉毒素合成途徑中的第一個(gè)代謝中間產(chǎn)物降盤散衣酸（norsolorinic acid，NOR）的產(chǎn)生，基因表達(dá)分析結(jié)果也顯示所有被檢測(cè)的黃曲霉毒素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)均被抑制。

6　結(jié) 語(yǔ)

黃曲霉毒素是在易受霉菌侵染的農(nóng)產(chǎn)品中主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。它們的產(chǎn)生取決于田間及貯藏過(guò)程中的環(huán)境條件。由于其不可避免和不可預(yù)測(cè)的特性，黃曲霉毒素污染對(duì)食品安全是一個(gè)很大挑戰(zhàn)，控制其攝入量和進(jìn)行體內(nèi)解毒是降低其對(duì)機(jī)體損害的有效方法。相當(dāng)多的證據(jù)表明黃曲霉毒素和某些動(dòng)物綜合癥有關(guān)。全世界的科學(xué)家集中研究黃曲霉毒素的生物合成已經(jīng)超過(guò)50 年。關(guān)于黃曲霉毒素合成的機(jī)理了解的越多，就越需要研究它的調(diào)控機(jī)理。黃曲霉毒素基因表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在多個(gè)層次，由多個(gè)調(diào)控組分控制。普遍接受的AFB1作用機(jī)理是AFBO生物活化結(jié)合到DNA形成AFB1-N7-鳥(niǎo)嘌呤。DNA損傷的另外一個(gè)可能原因是AFB1介導(dǎo)形成活性氧的刺激，導(dǎo)致DNA堿基的氧化。AFB1致癌機(jī)制的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，AFB1及其代謝產(chǎn)物可能通過(guò)影響ras、c-fos癌基因及p53、Survivin抑癌基因的表達(dá)等多種途徑引起肝癌發(fā)生。但由于缺乏直接的相關(guān)證據(jù)，AFB1致癌機(jī)制仍未能明確闡明，進(jìn)一步闡明黃曲霉毒素致癌機(jī)制，進(jìn)一步明確其致癌機(jī)制對(duì)有效干預(yù)減少其對(duì)人類和動(dòng)物的毒性有重要意義。

關(guān)于黃曲霉毒素生物合成基因調(diào)控和運(yùn)輸代謝更好的了解將會(huì)幫助確定真菌生長(zhǎng)和黃曲霉毒素形成的天然抑制劑。黃曲霉毒素生物合成和調(diào)控機(jī)理的基本知識(shí)有利于防控黃曲霉毒素的新型生物技術(shù)的發(fā)展。黃曲霉毒素的侵染可以通過(guò)采取適當(dāng)?shù)淖魑锕芾?、合適的貯藏來(lái)控制，同時(shí)可以采用物理、化學(xué)和生物方法來(lái)對(duì)毒素滅活及干預(yù)。最終目的是能夠設(shè)計(jì)有效新穎的策略來(lái)消除黃曲霉毒素污染，干預(yù)黃曲霉毒素的侵染代謝，從而保障更安全、營(yíng)養(yǎng)和可持續(xù)的食品和飼料供應(yīng)。

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Recent Progress in the Biosynthesis， Metabolism and Toxicity of Aflatoxins

LUO Zisheng1， QIN Yu1， XU Yanqun1， XU Tingqiao2， WEI Yunxiao2， HE Liangxing2
（1. Department of Food Science and Nutrition， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China；2. Hangzhou Yuhang District Agricultural Monitoring Centre， Hangzhou 311199， China）

Food contamination with aflatoxins is the focus of current concern. The i ntermittent incidence of these toxins in agricultural commodities has negative effects on the economy of the affected regions where harvest and postharvest techniques for the prevention of mold growth are seldom practiced. Aflatoxins are highly hepatotoxic， hepatocarcinogenic，teratogenic， and mutagenic in nature and they contaminate a wide variety of important agricultural commodities， such as peanuts， maize， rice and cottonseed， before， during and after harvest in various environmental conditions/settings. The biosynthesis of aflatoxins in nature depends upon the various factors such as carbon， nitrogen， temperature， water activity，pH， developmental stages， oxidative stress， and plant metabolites. These toxins can cause several ailments and can be controlled by blocking and interfering with the absorption and disturbing the metabolic enzymes. The present article overviews the biosynthesis， infection， transport， metabolism and toxicity of aflatoxins. Detailed studies on their biosynthesis，mechanism of toxicity， structure-function relationship， metabolism and transport will provide deep insight into the technology involved in the development of an effective control measures for aflatoxins.

aflatoxins； biosynthesis； infection； toxicity； mutation

TS201.6

A

1002-6630（2015）03-0250-08

10.7506/spkx1002-6630-201503048

2014-02-25

杭州市社會(huì)發(fā)展科研專項(xiàng)（20140533B61）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C32089）

羅自生（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称繁ｕr生物學(xué)。E-mail：luozisheng@zju.edu.cn