燕平梅，陳燕飛，趙文婧，喬宏萍，單樹花，張 騰

（太原師范學院生物系，山西 太原 030031）

蔬菜發(fā)酵菌種的篩選及發(fā)酵特性

燕平梅，陳燕飛，趙文婧，喬宏萍，單樹花，張 騰

（太原師范學院生物系，山西 太原 030031）

為了選擇適合蔬菜發(fā)酵的發(fā)酵菌種，本研究從四川泡菜老湯中分離的6 種乳酸菌Lactobacillus plantarum、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevi、Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus lactics篩選發(fā)酵菌種。6 種乳酸菌接入亞硝酸鹽的MRS培養(yǎng)液中，6 種乳酸菌還原亞硝酸鹽的大小順序為Lactobacillus pentosus＞Lactobacillus plantarum＞Leuconostoc mesenteroides＞Lactobacillus fermentum＞Lactobacillus lactics＞Lactobacillus brevis。以pH值降低的速率為發(fā)酵速率，Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides這3 種發(fā)酵劑的發(fā)酵速率較其他3 種快，并且通過乳酸菌的全細胞蛋白電泳實驗得出此3 種乳酸菌在甘藍發(fā)酵過程中能夠成為優(yōu)勢菌。從乳酸菌還原亞硝酸鹽的能力、發(fā)酵速率、發(fā)酵菌種的生存能力（是否能成為優(yōu)勢菌）的實驗結果表明Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides這3 種乳酸菌作為蔬菜發(fā)酵的發(fā)酵劑。通過對3 種發(fā)酵菌種發(fā)酵特性的研究可知，Leuconostoc mesenteroides較另兩種生長周期短，穩(wěn)定期維持時間短，很快進入衰退期。Lactobacillus plantarum菌較Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides耐酸，Leuconostoc mesenteroides對酸敏感。Leuconostoc mesenteroides最適生長溫度為30 ℃，Lactobacillus plantarum、Lactobacillus plantarum兩種菌的最適生長溫度是37 ℃。15 ℃條件下Leuconostoc mesenteroides的光密度（OD600nm）值很低，說明Leuconostoc mesenteroides較Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus對低溫敏感。

乳酸菌；蔬菜；發(fā)酵劑；泡菜；接種發(fā)酵

蔬菜發(fā)酵過程中，蔬菜代謝過程積累的硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，并在發(fā)酵過程中出現(xiàn)亞硝酸鹽含量高峰，稱為“亞硝峰”，之后亞硝酸鹽含量快速減少［1-7］。關于“亞硝峰”的產生，許多學者［8-10］都曾做過觀察，不同蔬菜品種、不同的發(fā)酵溫度及不同的氯化鈉濃度發(fā)酵蔬菜過程初期均形成亞硝高峰，發(fā)酵中期亞硝酸鹽快速下降，后期亞硝酸鹽含量很低，其含量低于我國GB 15198—1994《食品中亞硝酸鹽限量衛(wèi)生標準》中規(guī)定了各類食品中關于亞硝酸鹽的衛(wèi)生限量標準。

提高發(fā)酵蔬菜產業(yè)的生產效率和發(fā)酵蔬菜的品質，提早“亞硝峰”出現(xiàn)時間，降低“亞硝峰”的峰值是科研人員研究的焦點。前人通過調發(fā)酵液的pH值［11］和添加大蒜［12］、酸菜鮮［13］、VC［14］和采用純種發(fā)酵方法［15-18］降低發(fā)酵蔬菜中“亞硝峰”的峰值。其中純種發(fā)酵方法不僅可以降低發(fā)酵蔬菜中“亞硝峰”的峰值，而且能將自然發(fā)酵的諸多不足受控于人工操作之下，可以實現(xiàn)泡菜生產的現(xiàn)代化、工業(yè)化和規(guī)?；?。因此純種發(fā)酵方法將成為泡菜產業(yè)發(fā)展的主流方向。為了選擇適合蔬菜發(fā)酵的發(fā)酵菌種，本研究團隊在前期采用非培養(yǎng)和培養(yǎng)方法研究發(fā)酵蔬菜乳酸菌的多樣性的基礎上［19-20］，選擇了從四川泡菜老湯中分離的6 種乳酸菌，從乳酸菌還原亞硝酸的能力、發(fā)酵速率、發(fā)酵菌種的生存能力方面來選擇發(fā)酵劑。并對發(fā)酵菌種的性能進行研究。

1　材料與方法

1.1材料與菌種

甘藍來自中國農業(yè)大學附近的菜市場。

本實驗所用的乳酸菌是從泡菜老湯和泡菜鹵中分離的乳酸菌，有Lactobacillus plantarum（編號為BC1）、Lactobacillus fermentum（編號為W）、Lactobacillus brevis（編號為hp2）、Lactobacillus pentosus（編號為SPc）、Leuconostoc mesenteroides（編號為nPb）、Lactobacillus lactics（編號為Z）。

1.2方法

1.2.1發(fā)酵菌種的制備

制備流程如下：冰箱保存種→轉接MRS固體培養(yǎng)基活化→擴大培養(yǎng)（乳酸菌在液體MRS培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)24 h）→離心分離（4 000×g，5 min）集菌→稱質量。

1.2.2接種發(fā)酵甘藍的制備

稱取50 g洗凈瀝干的甘藍，放入滅菌的三角瓶中，加入含5 g/100 mL NaCl煮沸涼到室溫的鹽水100 mL，接入乳酸菌發(fā)酵劑（發(fā)酵劑/菜為0.5 g/100 mL），置于30 ℃培養(yǎng)箱中厭氧發(fā)酵。

在無菌條件下取發(fā)酵甘藍樣品，隔天測定發(fā)酵甘藍的亞硝酸鹽含量和可滴定酸濃度，發(fā)酵第4天取發(fā)酵菜水稀釋到適當的濃度涂布到含5% CaCO3MRS固體培養(yǎng)基中，挑取10 株乳酸菌，做發(fā)酵劑生存能力的實驗。

1.2.3發(fā)酵甘藍中亞硝酸鹽含量和可滴定酸的測定方法

可滴定酸的測定是由0.1 mol/L氫氧化鈉滴定，酚酞為滴定終點指示劑［21］。

泡菜鹵pH值測定用數字pH計，pH計的校準用廠商供給的pH值為4.0和7.0的標準緩沖溶液。

亞硝酸鹽含量的測定按GB/T 5009.33—1996《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定方法》［22］。

1.2.4乳酸菌生存能力實驗（用全細胞蛋白指紋圖譜法）

1.2.4.1乳酸菌全細胞蛋白的提取

將保藏的乳酸菌活化（用試管斜面或平皿），挑取5～7 環(huán)接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)3～8 h時，在4 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用滅菌的蒸餾水沖洗離心管的菌體，然后加入5 mL的滅菌的蒸餾水在4 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，加入0.5 mL的處理緩沖溶液（0.062 5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8；2 g/100 mL SDS；10%甘油），放入100 ℃沸水中煮5～8 min，然后放入-20 ℃冰箱中反復凍融2 次，在13 000×g離心10 min，收集上清液［14］（蛋白提取液），進行電泳。

1.2.4.2乳酸菌全細胞蛋白的瓊脂糖凝膠電泳

按照Isabel等［23］的方法，測定乳酸菌全細胞蛋白亞基組成，所用條件為12.5%分離膠，4.5%濃縮膠，交聯(lián)度3.6%，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），單板恒流10 mA，樣品溶液先與等體積樣品變性劑混合，沸水浴加熱5 min后，蛋白質提取液15 μL上樣，電泳后的分離膠用考馬斯亮藍R-250染色顯現(xiàn)蛋白帶。

1.2.5菌種發(fā)酵特性的實驗

經過活化的發(fā)酵菌種接入MRS液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，每隔3 h測定MRS液體培養(yǎng)基的OD600nm值，連續(xù)測定30 h。

分別將MRS液體培養(yǎng)基調不同pH值（3、4、5、6、7）和不同鹽質量濃度（2、4、6、8、12 g/100 mL），把培養(yǎng)18 h的菌株接種于其中，培養(yǎng)24 h后，600 nm波長處測培養(yǎng)液OD值。

將培養(yǎng)18 h的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，放于15、20、25、30、37、45 ℃條件下培養(yǎng)24 h，600 nm波長處測培養(yǎng)液OD值。

將培養(yǎng)18 h的菌株接種于含100 mg/L NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，測定培養(yǎng)液中NaNO2的含量。

2　結果與分析

2.1發(fā)酵菌種的篩選

2.1.1單菌種發(fā)酵甘藍中亞硝酸鹽含量在發(fā)酵過程中的變化

圖1　單菌種發(fā)酵甘藍菜中亞硝酸鹽含量在發(fā)酵過程中的變化Fig.1 Changes in nitrite content during single-strain fermentation of cabbages

6 種來源于泡菜乳酸菌為發(fā)酵劑發(fā)酵甘藍菜中亞硝酸鹽含量隨發(fā)酵時間的變化如圖1所示，純種發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽含量比自然發(fā)酵（空白）低。以W為發(fā)酵劑發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽含量較其他5 種純種發(fā)酵高，且在發(fā)酵2 周內出現(xiàn)兩次亞硝高峰，第一次高峰值出現(xiàn)在發(fā)酵第4天，較空白（自然發(fā)酵）晚2 d，第二次高峰值出現(xiàn)在發(fā)酵第12天，其峰值相對第一峰值低得多；Z為發(fā)酵劑時，亞硝酸鹽含量高峰在發(fā)酵第10天出現(xiàn)，且峰值較另外4 種發(fā)酵劑的高；SPc為發(fā)酵劑亞硝酸鹽含量高峰在發(fā)酵第2天出現(xiàn)；nPb作為發(fā)酵劑時，亞硝酸鹽含量高峰在第1天出現(xiàn)；hp2、BC1為發(fā)酵劑時，發(fā)酵甘藍中亞硝酸鹽含量在發(fā)酵過程中呈波動變化，但亞硝峰值較上述幾種發(fā)酵劑的低。本實驗發(fā)酵劑的選擇的標準是發(fā)酵中亞硝酸鹽高峰低、且“亞硝峰”出現(xiàn)早的發(fā)酵菌種?；诖藯l件，乳酸菌Z和W不適合作發(fā)酵菌種。

2.1.2單菌種發(fā)酵甘藍菜鹵pH值的變化

表1　單菌種發(fā)酵甘藍菜鹵pH值的變化Table1 Change in pH values during single-strain fermentation of cabbages

此實驗考察發(fā)酵劑的發(fā)酵蔬菜的速率，測試指標為發(fā)酵甘藍菜鹵pH值。如表1所示，Z、W和hp2為發(fā)酵劑時，發(fā)酵初期甘藍菜鹵的pH值降低緩慢。以nPb、BC1和SPc為發(fā)酵劑，甘藍菜鹵的pH值降低較hp2、Z和W快。從本實驗的結果得出，從發(fā)酵速率看nPb、BC1、SPc乳酸菌作為發(fā)酵劑較hp2、Z和W為好。

2.1.3乳酸菌作為發(fā)酵劑的生存生長能力

本實驗通過用全細胞蛋白電泳（蛋白指紋圖譜）的方法考察了接入菌種和其接入蔬菜發(fā)酵4 d的發(fā)酵鹵中隨機分離乳酸菌的電泳帶譜，如圖2A～2C所示，接入的BC1、nPb、SPc和含有接入菌的泡菜鹵中隨機分離7 株、9 株乳酸菌全細胞蛋白電泳圖譜是完全一樣，說明接入的菌種在蔬菜原料所帶的眾多野生菌環(huán)境中生存并成為優(yōu)勢的乳酸菌，在發(fā)酵過程中起優(yōu)勢主導菌群的作用。因此3 株菌株可以作為甘藍接種發(fā)酵的發(fā)酵劑。未接菌的泡菜中乳酸菌的全細胞蛋白帶譜不一樣（圖2D）。

圖2　BC1（A）、nPb（B）、SPc（C）菌種和未接菌（D）泡菜中乳酸菌的全細胞蛋白SDS-PAGE圖譜AGEFig.2 SDS-PAGE of whole cell proteins of LAB

2.2發(fā)酵菌種的生長性能

由上述實驗選出SPc、BC1、nPb為發(fā)酵菌株。對這3 株菌進行一系列性能測定，測定菌株的生長曲線，了解其生長周期及生長情況；對不同pH值的適應性是衡量菌株在不同酸堿條件下活動能力的一項重要指標；合適的發(fā)酵溫度可以兼顧發(fā)酵得快速進行，同時確保發(fā)酵產品的質地與口感；菌株對不同鹽量的適應能力則可拓展的應用范圍從而滿足不同地區(qū)對不同鹽量發(fā)酵要求。

2.2.1發(fā)酵菌株培養(yǎng)30 h的生長曲線和pH值的變化

圖3　菌液OODD60000nnmm值隨培養(yǎng)時間變化曲線Fig.3 Plot of OD600nmof bacterial cells versus culture time

圖4　菌液pH值隨培養(yǎng)時間變化曲線Fig.4 Plot of pH versus culture time

由圖3、4可知，nPb生長周期短，培養(yǎng)12 h進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期維持時間短，很快進入衰退期。培養(yǎng)液中產酸較慢，培養(yǎng)30 h時pH值下降為3.6左右。SPc、BC1培養(yǎng)16～18 h進入穩(wěn)定期，產酸快，24 h后pH值下降為3.6左右。

2.2.2發(fā)酵菌株對不同pH值和鹽質量濃度的適應性

圖5　不同pH值條件菌體的生長情況Fig.5 Effect of pH on the growth of bacterial cells

由圖5可知，nPb、BC1兩種菌株在pH值為6 h時OD600nm最大，SPc在pH值為5 h時OD600nm最高。SPc、nPb、BC1的最適生長pH值分別為5、6、6。BC1菌在pH值為3仍能生長，SPc、nPb生長微弱，說明BC1菌較SPc、nPb耐酸。nPb對酸敏感，在pH值為3的培養(yǎng)液中生長較SPc微弱，說明nPb對酸敏感。

圖6 不同鹽質量濃度下菌體的生長情況Fig.6 Effect of NaCl concentration on the growth of bacterial cells

圖6表示在不同鹽質量濃度條件下SPc、nPb、BC1這3 種菌株的OD600nm值，NaCl質量濃度在2～4 g/100 mL范圍內，SPc、nPb、BC1這3 種菌株生長良好。NaCl質量濃度為12 g/100 mL，3 種菌生長很微弱。BC1菌較SPc、nPb耐鹽，NaCl質量濃度達8 g/100 mL時，仍能很好地生長。nPb對鹽較SPc、BC1敏感，在NaCl質量濃度為12 g/100 mL時生長弱于其他兩株菌。

2.2.3發(fā)酵菌株的最適溫度

圖7　不同培養(yǎng)溫度下菌株生長情況Fig.7 Effect of cultivation temperature on the growth of bacterial cells over a 24-h cultivation period

由圖7可知，SPc、nPb、BC1這3 種菌在30、37 ℃條件下生長均旺盛。在45 ℃條件下生長都微弱。nPb最適生長溫度為30 ℃，SPc、BC1兩種菌的最適生長溫度是37 ℃。15 ℃條件下nPb的OD600nm很低，說明nPb較BC1、SPc對低溫敏感。

2.2.4乳酸菌還原亞硝酸鹽的能力

表2　6 種乳酸菌還原亞硝酸鹽能力的比較Table2 Comparisons of the nitrite-reducing abilities of six strains of lactic acid bacteria

如表2所示，6 種乳酸菌接入含100 mg/L亞硝酸鹽的MRS培養(yǎng)液中，3 d后培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽含量不一樣。說明它們還原亞硝酸鹽的能力有差異，每種乳酸菌還原亞硝酸鹽的的大小順序為SPc＞BC1＞nPb＞W＞Z＞hp2。

3　討 論

將發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵模式由傳統(tǒng)的自然發(fā)酵模式向純種發(fā)酵的現(xiàn)代模式過渡并且達到快速、穩(wěn)定和優(yōu)質的關鍵基礎在于菌種。迄今，純種發(fā)酵研究所用的發(fā)酵劑大多數來自乳制品或其他發(fā)酵食品［24-26］。因其在泡菜制作基質中適應性差，生長繁殖困難，配制出的菜品無泡菜獨有的品位。導致人工接種發(fā)酵蔬菜技術不能大面積推廣應用。

目前純種乳酸發(fā)酵采用的生產工藝模式是一種半人工半自然的特殊模式，接種前原料不經過熱燙處理，發(fā)酵原料中附著的自然微生物依然存在并參與發(fā)酵，而接入的純菌種只在發(fā)酵過程中起優(yōu)勢主導菌群的作用。這種純種發(fā)酵方法是常用的加工方法。接入的菌種能否在蔬菜原料所帶的眾多野生菌環(huán)境中生存并成為優(yōu)勢的乳酸菌是篩選發(fā)酵菌種的重要指標。本實驗通過用全細胞蛋白電泳（蛋白指紋圖譜）的方法考察了接入菌種和其接入蔬菜發(fā)酵4 d的發(fā)酵鹵中隨機分離乳酸菌的電泳帶譜，考察了從接種發(fā)酵亞硝酸鹽高峰值低和發(fā)酵過程pH值快速降低兩個指標篩選的菌種在蔬菜發(fā)酵體系中的生存生長能力，得出Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Leuconostoc mesenteroides能穩(wěn)定存在蔬菜發(fā)酵體系中并成為優(yōu)勢菌。

亞硝酸鹽的形成是發(fā)酵蔬菜的普遍規(guī)律，接種發(fā)酵選擇能夠使亞硝酸鹽含量降低的發(fā)酵劑是篩選發(fā)酵菌種的重要條件。蔬菜發(fā)酵過程中pH值快速降低不僅有效抑制其他不耐酸雜菌的繁殖，而且低pH值可以還原亞硝酸鹽。因此，選擇發(fā)酵速率快的發(fā)酵劑發(fā)酵對于得到優(yōu)質安全的泡菜產品是非常重要的。本研究先從發(fā)酵蔬菜制品中亞硝酸鹽含量和pH值兩個指標選擇發(fā)酵劑后檢驗其在發(fā)酵過程中生存及生長能力，確定作為蔬菜發(fā)酵的發(fā)酵菌種。然后研究其發(fā)酵特性，以為蔬菜人工接種發(fā)酵提供適宜的發(fā)酵劑。

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Screening and Fermentation Characteristics of Strains for Fermented Vegetables

YAN Pingmei， CHEN Yanfei， ZHAO Wenjing， QIAO Hongping， SHAN Shuhua， ZHANG Teng
（Department of Biology， Taiyuan Normal University， Taiyuan 030031， China）

This study aimed to screen the suitable strains for vegetable fermentation from six Lactobacillus species present in pickled vegetable， namely Lactobacillus plantarum， L. fermentum， L. brevis， L. Pentosus， L. mesenteroides and L. lactics. During culture in an MRS medium containing nitrite， these six strains of Lactobacillus could reduce the nitrite in the decreasing order: Lactobacillus pentosus ＞ Lactobacillus plantarum ＞ Leuconostoc mesenteroides ＞ Lactobacillus fermentum ＞ Lactobacillus lactics ＞ Lactobacillus brevis. The fermentation rates of L. plantarum， L. pentosus and L. mesenteroides， as indicated by pH reduction rates， were higher than those of three other strains. Furthermore， whole-cell protein electrophoresis indicated that L. plantarum， L. pentosus and L. mesenteroides were the dominant bacteria in cabbage fermentation. Their applicability as starter cultures for vegetable fermentation was also confirmed based on nitrite-reducing ability， fermentation rate and viability. Comparing their fermentation characteristics， it was found that the growth cycle and stationary phase of Leuconostoc mesenteroides were shorter than those of the other two strains， and entered the decline phase earlier. L. plantarum was more resistant to acids than L. pentosus and L. mesenteroides and Leuconostoc mesenteroides was more sensitive to acids. The optimal growth temperature for Leuconostoc mesenteroides was 30 ℃ whereas the optimal growth temperature for both L. plantarum and L. plantarum was 37 ℃. At 15 ℃， the optical density （OD600nm） of Leuconostoc mesenteroides was very low， indicating that it is more sensitive to low temperature than L. pentosus and L. plantarum.

lactic acid bacteria； vegetables； fermentation starter； pickle； inoculated fermentation

TS201.3

A

1002-6630（2015）03-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201503019

2014-03-05

國家自然科學基金面上項目（31171743）；山西省科技基礎條件平臺項目（2014091003-0107）

燕平梅（1968—），女，教授，博士，研究方向為食品科學與食品微生物。E-mail：yanpingmei@sohu.com