任 杰，胡志和，*，孫振剛，武文起，馮永強，李金星

（1.天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津 300402）

高靜水壓處理對牛初乳中IgG的影響

任 杰1，胡志和1，*，孫振剛2，武文起2，馮永強2，李金星1

（1.天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津 300402）

采取不同的高靜水壓條件（處理壓強、施壓溫度、保壓時間）處理產(chǎn)犢后48 h內(nèi)的牛 初乳，研究高靜水壓處理牛初乳對免疫球 蛋白G（immunoglobulin G，IgG）活性的影響。將牛初乳離心去除酪蛋白、乳脂肪等，取上清液進行高靜水壓處理，采用高效液相色譜法和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfa tepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對處理后的樣 品進行檢測。結果 表明：高靜水壓處理后的樣品，經(jīng)高效液相色譜儀檢測，其與親和色譜柱發(fā)生特 異性吸附的能力下降，IgG檢出質(zhì)量濃度降低；經(jīng)SDS-PAGE檢測和凝膠電泳成像儀掃描處理，不同處理條件下IgG的輕鏈和重鏈的質(zhì)量變化不顯著。因此，當牛初乳在200 MPa、30 ℃和20 min的高靜水壓處理條件下，IgG的活性最好，檢出質(zhì)量濃度為16.843 9 mg/mL。

牛初乳；免疫球蛋白G；高靜水壓；高效液相色譜；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

牛初乳富含維生素、礦物質(zhì)和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，以及生長因子等活性功能組分。牛初乳能抑制并消滅病原菌，增強人體免疫力、促進組織生長、減少對抗生素的依賴性，且無任何副作用［1-2］，是替代人初乳的優(yōu)良資源［3］。IgG是重要的免疫球蛋白，也是牛初乳中最重要的免疫因子，它占免疫球蛋白總組分的80%～90%［4］，能部分取代人類母乳IgA的功能［5］。然而，牛初乳加工中常用的處理方式有冷凍干燥和噴霧干燥。由于牛初乳耐熱性能差，加熱至60 ℃以上即開始形成凝塊，噴霧干燥對IgG等活性成分破壞較大、營養(yǎng)成分損失多；冷凍干燥滅菌效果差、生物安全性不佳?，F(xiàn)采用高靜水壓技術（又稱超高壓技術）［6］，該技術是一個純粹利用物理作用處理食品的過程，其優(yōu)勢在于殺滅微生物的同時不破壞食品中的營養(yǎng)成分、色澤以及風味。

蘇丹［7］、Puppo［8］等的研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)過高壓處理后結構會發(fā)生變化，張和平等［9］在室溫下高壓處理牛乳20 min后發(fā)現(xiàn)，IgG的變性程度隨著處理壓強增大而增加。本實驗采用高靜水壓技術處理牛初乳，研究其對牛初乳中IgG的影響，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對其進行檢測，并輔以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測L鏈和H鏈的質(zhì)量變化，為牛初乳制品的研究和開發(fā)提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牛初乳（產(chǎn)犢48 h內(nèi)）由天津市武清區(qū)德興隆奶業(yè)有限公司提供。

IgG標準品 北京成文免疫化學研究室；濃鹽酸 天津市化學試劑批發(fā)公司；NaOH、KH2PO4、乙醇（色譜純） 天津市贏達稀貴化學試劑廠；甲醇（分析純）、冰乙酸（分析純） 天津市風船化學試劑科技有限公司；L-5750 Sigma SDS、252859 Sigma Tris、G7126 Sigma甘氨酸 美國Sigma公司；實驗用水均為超純水。

1.2儀器與設備

HPP.L3-600/0.6超高壓設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；Hi-Trap Protein G HP（1 mL）色譜柱 宜科思源科技有限公司；1500Q05/2000ES全自動四元梯度高效液相色譜儀 美國科學系統(tǒng)公司；3-16PK離心機 美國Sigma公司；KQ-250B超聲波振蕩器 上海五相儀器儀表有限公司；Bio-Rad凝膠電泳成像儀 美國Bio-Rad公司；JY-SCZ2+型電泳槽、JY600型電泳儀北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3牛初乳的高靜水壓處理條件

初乳清的制備：牛初乳于4 ℃、5 000 r/min離心30 min除去脂肪，再將脫脂后的初乳繼續(xù)于4 ℃、4 000 r/min離心35 min，棄去底部的酪蛋白沉淀和上層的殘余油脂，即可得到初乳清［10］。

量取制備的初乳清裝于聚乙烯塑料袋內(nèi)，抽真空、密封后進行高靜水壓處理，采用HPLC法和SDS-PAGE法檢測高壓處理后初乳清樣品中的IgG，對照組為未經(jīng)高靜水壓處理的初乳清。

1.3.1處理壓強對牛初乳中IgG的影響

施壓溫度為30 ℃，保壓時間為20 min，處理壓強分別選取100、200、300、400、500、600 MPa的條件處理初乳清。

1.3.2施壓溫度對牛初乳中IgG的影響

處理壓強為350 MPa，保壓時間為20 min，施壓溫度分別選取20、25、30、35、40 ℃的條件處理初乳清。

1.3.3保壓時間對牛初乳中IgG的影響

處理壓強為350 MPa，施壓溫度為30 ℃，保壓時間分別選取10、20、30、40、50、60 min的條件處理初乳清。

1.4HPLC法檢測IgG［11］

1.4.1溶液的配制

流動相A液：pH 6.5、0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液；流動相B液：pH 2.5、0.05 mol/L的甘氨酸鹽酸緩沖液。

實驗用水和流動相先用0.45 μm微孔濾膜過濾，再經(jīng)過超聲波脫氣30 min后再上樣分析。

試樣的處理和溶液的配制按照GB/T 5009.194—2003《保健食品中免疫球蛋白IgG的測定》進行操作，每個樣品平行測定3 次，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后上樣分析。

1.4.2HPLC分析條件

色譜柱：Pharmacia Hi-Trap Protein G柱，1 mL；流速：0.4 mL/min；柱溫：25 ℃；波長：280 nm；進樣體積：20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1　高效液相色譜法檢測IgG的梯度洗脫程序Table1 Gradient elution conditions for IgG detection by HPLC

1.4.3繪制IgG標準曲線

稱取IgG標準品，用流動相A液稀釋成IgG的質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL的標準系列，臨用時配制，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后上樣分析，每個質(zhì)量濃度分別設置3 個平行。根據(jù)紫外檢測器讀出波長280 nm處的吸光度，以IgG的質(zhì)量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制IgG不同質(zhì)量濃度的標準曲線。

1.4.4SDS-PAGE法檢測牛初乳中的IgG

電泳條件：pH 8.8、12%分離膠和pH 6.8、5%濃縮膠，上樣緩沖液是2×SDS緩沖液，電泳緩沖液是Tris-甘氨酸電泳緩沖液，上樣量為10 μL，200 V恒壓電泳70 min，染色40 min，脫色過夜。

條帶含量檢測：采用Bio-Rad凝膠電泳成像分析儀對條帶進行凝膠成像處理，Quantity One軟件分析條帶含量。

1.5數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖表制作利用軟件Quantity One和Excel 2007。

2　結果與分析

2.1 IgG的標準曲線及色譜圖

本實驗所得IgG質(zhì)量濃度的標準曲線方程為：y=741 070x+652 107，相關系數(shù)R2=0.999 5，表明IgG在所設定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，結果具有較高的可信度。圖1是IgG標準品的高效液相色譜圖，圖2是350 MPa、30 ℃保壓20 min的高壓處理條件下牛初乳樣品中IgG色譜圖。其中，未經(jīng)高靜水壓處理的對照組樣品中IgG的質(zhì)量濃度平均值為30.977 mg/mL。

圖1　IgG標準品色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of IgG

圖2　350 MPa、30 ℃保壓20 min的高壓處理條件下牛初乳樣品中IggGG色譜圖Fig.2 Chromatogram of IgG in bovine colostrums treated with 350 MPa pressure at 30 ℃ for 20 min

2.2壓強大小對牛初乳IgG活性的影響

當施壓溫度和保壓時間分別為30 ℃和20 min時，選取100、200、300、400、500、600 MPa的壓強條件處理初乳清，HPLC法檢測結果如圖3所示，SDS-PAGE法檢測結果如圖4、表2所示。

圖3　30 ℃保壓20 min條件下不同壓強處理對牛初乳中IgG的影響Fig.3 Effect of different pressure treatments at 30 ℃ for 20 min on IgG concentration of bovine colostrums

由圖3可知，將其與對照組初乳清中IgG的質(zhì)量濃度進行比較，發(fā)現(xiàn)牛初乳經(jīng)過高靜水壓處理后，用HPLC法檢測質(zhì)量濃度與對照組（30.977 mg/mL）相比明顯下降。在實驗壓強范圍內(nèi)，當壓強從100 MPa升高到200 MPa時，IgG的檢出質(zhì)量濃度增加顯著；繼續(xù)升高壓強，IgG的檢出質(zhì)量濃度則逐漸減??；在200 MPa時，IgG的檢測值最高，為16.843 9 mg/mL；在600 MPa時最低，為4.649 4 mg/mL。這種變化的原因可能是由于壓強的變化導致蛋白質(zhì)的分子結構發(fā)生變化，使其與親和色譜柱發(fā)生特異性吸附的能力下降，而且操作壓強越大，分子結構變化越嚴重，結合能力越弱［12］。

圖4　30 ℃保壓20 min條件下經(jīng)不同壓強處理后牛初乳的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis patterns for bovine colostrums treated with different pressures at 30 ℃ for 20 min

SDS-PAGE檢測結果如圖4所示。根據(jù)SDS-PAGE原理，SDS多肽復合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的分子質(zhì)量有關，如條帶1中下面是IgG的輕（L）鏈，上面是IgG的重（H）鏈，且H鏈的量要高于L鏈［13］。Quantity One軟件分析IgG中L鏈和H鏈含量的比例結果如表2所示，L鏈和H鏈在不同處理壓強下占各自泳道的含量幾乎沒有什么變化，比例雖然不一致，但相差不大，顯著性分析結果亦顯示L鏈和H鏈的質(zhì)量變化不顯著，說明高靜水壓處理并沒有導致IgG質(zhì)量的減少。

表2　30 ℃保壓20 min條件下經(jīng)不同壓強處理后牛初乳中IgG的輕鏈和重鏈含量的比例Table2 Content ratios of light and heavy chains in IgG for bovine colostrums treated with different pressures at 30 ℃ for 20

表2　30 ℃保壓20 min條件下經(jīng)不同壓強處理后牛初乳中IgG的輕鏈和重鏈含量的比例Table2 Content ratios of light and heavy chains in IgG for bovine colostrums treated with different pressures at 30 ℃ for 20

注：a. 與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；b. 與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。表3、4同。

壓強/MPa0.1（對照組）100200300400500600 L鏈含量/%13.4±0.3a12.7±0.4a13.1±0.1a13.2±0.1a12.9±0.1a12.9±0.2a12.8±0.3aH鏈含量/%33.3±0.3a32.6±0.3a32.9±0.2a33.3±0.3a32.9±0.2a32.9±0.1a32.7±0.3a

2.3施壓溫度對牛初乳中IgG活性的影響

當處理壓強和保壓時間分別為350 MPa和20 min時，選取20、25、30、35、40 ℃的溫度條件處理初乳清，高效液相色譜法檢測結果如圖5所示，SDS-PAGE法檢測結果如圖6和表3所示。

圖5　350 MPa保壓20 min條件下不同溫度處理對牛初乳中IgG的影響Fig.5 Effect 350 MPa pressure treatment at different temperatures for 20 min on IgG concentration of bovine colostrums

由圖5可知，與對照組（30.977 mg/mL）相比，經(jīng)過高靜水壓處理以后，牛初乳中IgG的檢出質(zhì)量濃度下降。在所測溫度范圍內(nèi)，牛初乳中的IgG在25 ℃時檢出質(zhì)量濃度最低，為3.131 6 mg/mL。當溫度低于25 ℃時，IgG的檢出質(zhì)量濃度隨著溫度的升高而降低；當溫度高于25 ℃時，變化趨勢則與之相反；當溫度達到40 ℃時，IgG的檢出質(zhì)量濃度明顯提高，達到14.710 1 mg/mL。由于高壓條件下溫度對IgG空間的結構有影響［14］，導致牛初乳中IgG的檢出質(zhì)量濃度發(fā)生變化。

圖6　350 MPa保壓20 min條件下經(jīng)不同溫度處理后牛初乳的SDS-PAGE圖譜AGEFig.6 SDS-PAGE electrophoresis patterns for bovine colostrums treated with 350 MPa pressure at different temperatures for 20 min

由圖6可知，處理后樣品的IgG的輕鏈和重鏈條帶沒有明顯的不同，由表3可知，在不同的施壓溫度下，L鏈含量差僅為1.2%，H鏈含量差為1.0%，兩者都沒有明顯的不同，說明高靜水壓處理對IgG中L鏈和H鏈的質(zhì)量沒有明顯影響。

表3　350 MPa保壓20 min條件下不同溫度處理后牛初乳中IgG的輕鏈和重鏈含量Table3 Content ratios of light and heavy chains in IgG in bovinecolostrums treated with 350 MPa pressure at different temperatures for2 min

表3　350 MPa保壓20 min條件下不同溫度處理后牛初乳中IgG的輕鏈和重鏈含量Table3 Content ratios of light and heavy chains in IgG in bovinecolostrums treated with 350 MPa pressure at different temperatures for2 min

溫度/℃對照組2025303540 L鏈含量/%12.5±0.4a13.0±0.3a12.8±0.3a13.4±0.3a12.2±0.4b13.0±0.3aH鏈含量/%34.6±0.4a35.2±0.4a34.9±0.3a35.4±0.5a34.4±0.4a34.9±0.1a

2.4保壓時間對牛初乳中IgG活性的影響

當處理壓強和施壓溫度為350 MPa和30 ℃時，分別選取10、20、30、40、50、60 min的時間條件處理牛初乳，HPLC法檢測結果如圖7所示，SDS-PAGE法檢測結果如圖8和表4所示。

圖7　350 MPa施壓溫度30 ℃條件下不同時間處理對牛初乳中IgG的影響Fig.7 Effect of 350 MPa pressure treatment at 30 ℃ for different time periods on IgG concentration of bovine colostrums

對照組中IgG的檢出質(zhì)量濃度為30.977 mg/mL，而經(jīng)高靜水壓處理后，由圖7可知，牛初乳中IgG的檢出質(zhì)量濃度與對照組樣品相比均比較低。在保壓時間變化范圍內(nèi)，牛初乳中的IgG含量隨著保壓時間的延長而逐漸減少。當保壓時間為10 min時，IgG的檢出質(zhì)量濃度為15.743 2 mg/mL；當保壓時間達到60 min時，IgG的檢出質(zhì)量濃度為2.826 0 mg/mL，前后變化顯著，說明保壓時間對牛初乳中IgG與色譜柱結合活性影響較大。

圖8　350 MPa施壓30 ℃條件下經(jīng)不同保壓時間處理后牛初乳的SDS-PAGE圖譜AGEFig.8 SDS-PAGE electrophoresis patterns for bovine colostrums treated with 350 MPa pressure at 30 ℃ for different time periods

表4 350 MPa施壓30 ℃條件下不同保壓時間處理后牛初乳中IgG的輕鏈和重鏈含量Table4 Content ratios of light and high chains in IgG in bovine colostrums treated with 350 MPa pressure at 30 ℃ for different timeprods

表4 350 MPa施壓30 ℃條件下不同保壓時間處理后牛初乳中IgG的輕鏈和重鏈含量Table4 Content ratios of light and high chains in IgG in bovine colostrums treated with 350 MPa pressure at 30 ℃ for different timeprods

時間/min0（對照組）102030405060 L鏈含量/%12.0±0.4a11.5±0.4a11.0±0.3b12.3±0.3a12.0±0.2a11.5±0.3a11.7±0.2aH鏈含量/%34.3±0.4a33.6±0.3a33.4±0.5a34.3±0.4a34.2±0.4a33.1±0.5b33.7±0.2a

由圖8和表4可知，牛初乳IgG中L鏈和H鏈含量的比例之間的差值不大，顯著性分析結果顯示，當保壓時間為20 min時，牛初乳IgG中L鏈的含量比例與對照組有顯著性差別，當保壓時間為50 min時，此時牛初乳中H鏈的含量比例與對照組有顯著性差別，但平均值之間進行比較卻相差不大，表明高靜水壓處理對IgG分子L鏈和H鏈的質(zhì)量并沒有影響。

3　討 論

IgG分子是由兩條L鏈和兩條H鏈通過兩個二硫鍵（—S—S—）連接所成［15］，其結構區(qū)域分為C端的穩(wěn)定區(qū)（C區(qū)）和N端的可變區(qū)（V區(qū)），可變區(qū)又分為超變區(qū)和骨架區(qū)［16］。HPLC法采用親和色譜柱，免疫親和固定相以蛋白質(zhì)A為配位體，特異性結合IgG分子中的穩(wěn)定區(qū)域Fc段［17］。高靜水壓處理后IgG的活性降低，因為高壓可使IgG分子變性，IgG的Fc段與親和色譜柱的固定相結合能力下降，檢出質(zhì)量濃度降低。Trujillo等［18］研究發(fā)現(xiàn)，高壓處理會降低IgG的活性，與本實驗中IgG的活性變化相符。酶聯(lián)免疫法檢測高壓處理的牛初乳時，IgG活性出現(xiàn)一定的增加［19］，這與HPLC法檢測的結果存在差異。原因可能在于酶聯(lián)免疫中抗原與抗體發(fā)生特異性結合的位置在超變區(qū)域［20］；酶聯(lián)免疫檢測的樣品未經(jīng)離心處理，牛初乳中的脂肪等物質(zhì)會在超高壓處理時形成一定的保護作用。

Masuda等［21］采用SDS-PAGE檢測經(jīng)過高靜水壓處理牛初乳中的免疫球蛋白，IgG的L鏈和H鏈的含量并沒有發(fā)生變化，這與本實驗結果一致。高靜水壓處理后IgG的活性降低而L鏈和H鏈的含量卻沒有減少，其原因是高壓處理導致IgG分子結構發(fā)生變化，而SDS-PAGE檢測時IgG分子的L鏈和H鏈均被打開，其分子結構的改變并不影響電泳條帶。

4　結 論

高壓處理改變了IgG分子的高級結構，使其與親和色譜柱發(fā)生特異性結合的能力下降，從而導致活性的降低，檢出質(zhì)量濃度下降，當處理壓強為200 MPa、施壓溫度為30 ℃、保壓時間為20 min時牛初乳中IgG的活性最強，檢出質(zhì)量濃度最高，但是超高壓處理并不會破壞蛋白質(zhì)分子的一級結構，IgG的質(zhì)量不會發(fā)生變化。

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Effects of High Hydrostatic Pressure on IgG in Bovine Colostrum

REN Jie1， HU Zhihe1，*， SUN Zhengang2， W U Wenqi2， FENG Yongqiang2， LI Jinxing1
（1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134， China； 2. Tianjin Haihe Dairy Co. Ltd.， Tianjin 300402， China）

The objective of this study was to investigate the effects of high hydrostatic pressure on IgG in bovine colostrum. Bovine colostrum collected at 48 h after calving was treated under varying conditions of pressure， temperature and holding time， and subsequently centrifuged to remove casein， milk fat and other substances. The supernatant was treated with different high hydrostatic pressures， and the treated samples were analyzed by HPLC and SDS-PAGE electrophoresis. The HPLC results showed that for the sample treated by high hydrostatic pressure， the specific adsorption ability with affinity chromatography column was reduced and IgG was detected from it at a lower concentration. Moreover， the light and heavy chains of IgG were not changed significantly as shown by SDS-PAGE electrophoresis analysis and gel electrophoresis imaging scanner. Therefore， optimal IgG activity was obtained， and the detectable concentration was 16.843 9 mg/mL when bovine colostrum was treated with high hydrostatic pressure at 200 MPa and 30 ℃ for 20 min.

bovine colostrum； immunoglobulin G （IgG）； high hydrostatic pressure； high performance liquid chromatography（HPLC）； sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）

TS525.41

A

1002-6630（2015）03-0063-05

10.7506/spkx1002-6630-201503012

2014-02-10

天津市科技計劃項目（14ZCZDNC00017）；天津市高等學校創(chuàng)新團隊項目（TD12-5049）

任杰（1988—），女，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：renjie9631@163.com

胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn