賈 巧， 陳 華， 趙榮華， 任小姍， 夏之寧

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶　400044）

基于抗氧化活性的丹參藥品質(zhì)量評價研究

賈 巧， 陳 華*， 趙榮華， 任小姍， 夏之寧

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400044）

目的 提出從抗氧化能力評價藥物質(zhì)量的新觀點。方法 采用Luminol-Fe2+-H2O2流動注射化學(xué)發(fā)光體系評價了3種抗氧化劑單體和8種丹參藥品的抗氧化能力，以藥物對羥自由基的清除率對濃度作多項式四階擬合，由擬合方程計算出各自IC50值，以IC50值表示自由基清除能力，從而直接反應(yīng)8種丹參藥品的抗氧化能力。結(jié)果 該方法有較好的穩(wěn)定性和精密度，峰面積的RSD分別為2.3%和3.2%?？寡趸瘑误w和丹參各種藥品都表現(xiàn)為低濃度下羥自由基清除率與濃度成正比，高濃度則不然。結(jié)論 該方法簡單，高效，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高?？赏茝V應(yīng)用于各抗氧化型藥物的質(zhì)量的實際療效的初步評價。

抗氧化能力；質(zhì)量評價；丹參藥品；羥自由基；化學(xué)發(fā)光

氧自由基是生物體新陳代謝的中間產(chǎn)物［1］，活性比分子態(tài)氧高很多［2］。正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但當(dāng)生物體長期處于各種脅迫狀態(tài)下，氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝出現(xiàn)失衡［3］，過多的活性氧可以引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)的損傷、嘌呤氧化、堿基突變、DNA鏈的斷裂和突變［4］等，繼而引起細胞凋亡、組織壞死甚至機體死亡［5］。目前已證實與自由基相關(guān)的疾病有炎癥、心血管疾病、衰老［6］、帕金森氏病［7］、腫瘤、缺血性疾病、中毒和放射性疾病［8］等。

丹參是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥材，其治療心腦血管疾病的作用與其含抗氧化活性成分有關(guān)，主要是通過清除已產(chǎn)生的自由基和阻斷自由基鏈反應(yīng)從而保護心臟免受傷害［9］。大量研究表明丹參在多方面具有較強的抗氧化活性，在治療活性氧誘發(fā)的心腦血管疾病方面具有顯著的療效［10］。

傳統(tǒng)的藥物質(zhì)量的好壞是采用其中所含的某一種或某一類有效成分的多少進行評價的［11］，該方法的缺點是與藥物的實際治療效果脫節(jié)。藥物療效與藥效成分含有量固然有關(guān)，但不一定是正相關(guān)，含有量高不一定療效就好，有時還會出現(xiàn)相反的情況。丹參藥物在治療心腦血管疾病，發(fā)揮療效的過程中受多方面因素的影響，最根本的因素還是與藥物本身清除致病因子或修復(fù)損傷的能力有關(guān)［12］。丹參藥物對氧自由基的清除能力能直接反應(yīng)對心腦血管疾病的治療效果。本實驗欲從其抗氧化能力方面對系列丹參藥品的質(zhì)量進行評價，建立抗氧化型藥物質(zhì)量評價的新方法和新思路。

1　儀器與試藥

1.1儀器 IFFM-E型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；KQ-100型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGC-16B高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DELTA 320 pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2藥品與試劑 Luminol、兒茶素、丹參素鈉、綠原酸、楊梅素，均為Sigma公司產(chǎn)品（純度≧98%），無水乙醇、過氧化氫、FeSO4·7H2O、Na2CO3、NaHCO3均為國產(chǎn)分析純，實驗用水都為去離子水。8種丹參藥品采購自重慶市某藥店，廠家和生產(chǎn)批次信息列于表1。

表1　丹參系列藥物信息

2　實驗方法

2.1化學(xué)發(fā)光檢測條件 光電倍增管負(fù)高壓600 V，增益為1，管路內(nèi)徑0.8 mm，主副泵轉(zhuǎn)速40 r/min相當(dāng)于2.27 mL/min的體積流量，采樣時間1 s。

2.2溶液配制 0.025 mmol/L的Luminol用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖溶液（pH 10.50）配制；0.048%的H2O2用去離子水配制；10 mmol/L Fe2+，加入少量鐵粉和稀硫酸，臨用時用去離子水稀釋到0.02 mmol/L。

2.3樣品前處理 準(zhǔn)確稱取丹參藥品0.5 g，用50%乙醇溶解，超聲30 min后放置室溫后定容到50 mL量瓶。將樣品溶液在5 000 r/min下高速離心10min取上清液作樣品待測溶液。

將藥物溶液稀釋成一系列濃度，分別測定其·OH清除率，把清除率對濃度作非線性回歸擬合，得到兩者的量效關(guān)系，求出當(dāng)清除率為50%時對應(yīng)的濃度，即為各自的IC50值。IC50越小說明其抗氧化能力越強。

3　結(jié)果與討論

3.1流動注射化學(xué)發(fā)光法參數(shù)優(yōu)化

3.1.1流路的選擇 考察了兩種流路對抗氧化劑抗氧化能力評價的影響（圖1）。流路A可從譜圖上直接反應(yīng)出抗氧化劑清除·OH的程度，但溶劑空白亦可使發(fā)光降低50%左右，會掩蓋抗氧化劑的信號峰，使抗氧化劑的自由基清除率為負(fù)值，表觀顯示為促氧化作用，與實際相矛盾。Katerina等［14］對此現(xiàn)象進行了系統(tǒng)研究，但未能解決溶劑倒峰的現(xiàn)象。流路B則可避免這種現(xiàn)象，因此后續(xù)實驗中選擇流路B的混合模式。

圖1　化學(xué)發(fā)光流路圖

3.1.2Luminol濃度的選擇 用單因素變量法，考察了Luminol濃度在0.001～0.030 mmol/L之間對發(fā)光強度、峰形、峰面積的影響。結(jié)果顯示發(fā)光強度隨濃度的增大而增大，但噪聲亦同時增大，發(fā)光試劑殘留也增多，峰對稱性也變差。綜合考慮各種因素，最終確定Luminol濃度為0.025 mmol/L。

3.1.3H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 同樣又考察了H2O2在0.030%～0.060%之間的發(fā)光情況。結(jié)果顯示隨H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，發(fā)光強度先增加后減小，在H2O2為0.048%時峰形好，峰面積最大，且噪聲也小。因此選擇H2O2的使用液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.048%。

3.1.4Fe2+濃度的選擇 Fe2+是Fenten反應(yīng)中的催化劑，一般催化劑具有用量少，高效率的特點。但Fe2+在堿性條件下不能穩(wěn)定存在，容易被水中溶解氧化生成氫氧化鐵紅色沉淀，附著在管道內(nèi)壁，堵塞管道。因而鐵濃度不能過高?？疾炝藵舛仍?.020～0.100 mmol/L之間的Fe2+對發(fā)光情況的影響。結(jié)果顯示Fe2+濃度對發(fā)光強度影響很小，因此本實驗選用0.02 mmol/L Fe2+作為使用液。

3.1.5pH的選擇 Luminol須在堿性條件下發(fā)光，但Fe2+在堿性條件下不穩(wěn)定，因此考察了不同pH緩沖溶液的發(fā)光情況。結(jié)果發(fā)光強度隨著pH的增大先增大后減小。在pH為10.50時達到最大值，故本實驗選用緩沖溶液pH 10.50。

3.1.6體積流量的選擇 實驗考察了泵轉(zhuǎn)速在10～70 r/min相當(dāng)于體積流量0.57～3.99 mL/min下的化學(xué)發(fā)光情況。結(jié)果顯示：低體積流量時由于縱向擴散導(dǎo)致峰展寬。高體積流量下反應(yīng)量加大，峰高增高，峰形變好，如圖2。但反應(yīng)體系流過檢測窗口的速度過快，反應(yīng)不充分，在發(fā)光強度還未達到峰值時，液流已經(jīng)流過檢測窗，因而峰寬變窄，峰面積減小。綜合考慮峰形、峰寬、峰面積，本實驗選擇主副泵同步轉(zhuǎn)速40 r/min，體積流量為2.28 mL/min。

圖2　不同體積流量的化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線

3.1.7穩(wěn)定性試驗和精密度試驗 在選定最優(yōu)實驗條件和最佳儀器參數(shù)后對發(fā)光體系的穩(wěn)定性進行了考察。每隔2 h測定1次，共測定1 d內(nèi)5個時間段內(nèi)的空白發(fā)光強度，每次平行測5次。計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，峰高的RSD為1.5%，峰面積的RSD為2.3%，結(jié)果表明在1 d內(nèi)該發(fā)光體系穩(wěn)定。為了考察所建立體系的重復(fù)性，重復(fù)11次測定空白發(fā)光強度，計算其峰高、峰面積的RSD分別為3.4%和3.2%。結(jié)果表明測量結(jié)果的重復(fù)性良好。

3.2抗氧化劑單體的抗氧化能力評價 為考察方法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，實驗選擇了丹參素鈉、兒茶素、綠原酸3種抗氧化劑單體的不同質(zhì)量濃度對·OH的清除作用，以清除率y對質(zhì)量濃度x作多項式4階擬合，結(jié)果如表2所示。

表2　抗氧化劑單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

結(jié)果表明，抗氧化劑的抗氧化能力與其含有量并非呈正比。根據(jù)擬合曲線，計算獲得了各自的IC50值，IC50值越小表示其抗氧化能力越強，3種抗氧化劑的抗氧化能力大小依次為兒茶素＞丹參素鈉＞綠原酸。酚類化合物抗氧化活性大小通常與分子中羥基的個數(shù)和位置相關(guān)。尤其是苯環(huán)上的羥基，由于氧的電子與芳香環(huán)電子共軛的影響，對氫離子的束縛能力減弱，相對容易給出氫離子自身被氧化成醌而具有較強的還原性，而脂肪鏈上的羥基則被氧化為醛、酮或羧酸。此外，分子內(nèi)氫鍵越多，抗氧化活性越強［15］，試驗測定結(jié)果與理論相吻合，說明該方法測定結(jié)果可靠，可應(yīng)用于后續(xù)試驗研究。

3.3丹參藥品的抗氧化能力評價

3.3.1樣品清除率比較 分別取各樣品溶液用50%乙醇稀釋50倍后成200 mg/L的質(zhì)量濃度，以50%乙醇做空白對照，按照“3.1”項所示的方法測定清除率。測定結(jié)果如表3所示。

表3　高質(zhì)量濃度（200 mg/L）下各丹參藥品的自由基清除率比較（%）

從表3可以看出8種丹參藥物在質(zhì)量濃度為200 mg/L時都具有較高的羥自由基清除率，其中6#樣品清除率達到99%，其清除率大小依次為6#＞7#＞3#＞8#＞1#＞2#＞4#＞5#。

3.3.2樣品IC50比較 根據(jù)藥物清除率能力差異選擇不同質(zhì)量濃度范圍對樣品進行稀釋，測定各自清除率，清除率對質(zhì)量濃度的擬合方程如表4所示。計算各自IC50值亦如表4所示，IC50大小依次為3#＜6#＜1#＜2#＜7#＜8#＜4#＜5#，即抗氧化能力順序為3#＞6#＞1#＞2#＞7#＞8#＞4#＞5#。

表4　丹參藥物清除率y-質(zhì)量濃度x曲線擬合和IC50值

樣品的清除率排序與抗氧化能力排序差別的原因正是因為高質(zhì)量濃度下抗氧化劑抗氧化能力與質(zhì)量濃度之間不呈正比關(guān)系。而對于一個確定的體系而言，IC50值是一個定值，與抗氧化劑的質(zhì)量濃度無關(guān)。因此建議此類型實驗都采用IC50值來表示抗氧化能力大小。

4　結(jié)論

建立了評價丹參藥品抗氧化能力的流動注射化學(xué)發(fā)光法，對該發(fā)光體系進行各種參數(shù)優(yōu)化，考察了方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。該方法簡單、高效、快速、精密度高、穩(wěn)定性好。將該方法應(yīng)用于3種抗氧化劑單體和8種丹參藥品的抗氧化能力評價，結(jié)果表明低質(zhì)量濃度下抗氧化劑的自由基清除率與質(zhì)量濃度成正比，高質(zhì)量濃度則不然。把清除率對質(zhì)量濃度作多項式4階擬合時，曲線擬合度良好。3種抗氧劑的抗氧化能力大小依次為兒茶素＞丹參素鈉＞綠原酸。8種丹參藥物的抗氧化能力大小依次為3#＞6#＞1#＞2#＞7#＞8#＞4#＞5#。

化學(xué)發(fā)光法最大優(yōu)點是不需要光源，操作成本低，適合于抗氧化型藥物的抗氧化能力效果的總體評價。

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B

1001-1528（2015）03-0667-04

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2014-01-09

國家自然科學(xué)基金（21005092）；科技部國際合作計劃項目（2010DFA32680）

賈 巧（1988—），女，碩士，從事天然產(chǎn)物活性成分篩選。Tel：18227678557，E-mail：missjia880519@163.com

陳 華 Tel：（023）65106615，E-mail：chenhuacqu@aliyun.com