劉鴻昊，徐秋亞，劉 超*

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室，河南　鄭州　450052）

?基礎(chǔ)研究?

血管平滑肌細胞鈣化后轉(zhuǎn)化類型的研究

劉鴻昊，徐秋亞，劉 超*

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室，河南鄭州450052）

目的 分析主動脈血管平滑肌細胞鈣化后細胞轉(zhuǎn)化類型。方法 將第4代細胞等量隨機分為實驗組和對照組，給予實驗組10 mmol/L的β-甘油磷酸鹽進行細胞誘導(dǎo)，給予對照組正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10天，測定兩組堿性磷酸酶（ALP）活性及骨鈣素的含量，采用Western blot方法檢測VSMCs及成骨細胞標志蛋白（骨橋蛋白）含量的差異。結(jié)果 細胞誘導(dǎo)鈣化后，細胞聚集并形成囊泡結(jié)構(gòu)，實驗組ALP、骨鈣素含量較對照組有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot顯示成骨細胞標志物含量較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達逐漸增強，對照組僅有微弱表達，且隨時間無明顯變化，實驗組OPN的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 主動脈血管平滑肌細胞在鈣化后會向成骨細胞轉(zhuǎn)化，可為血管鈣化通路、病因及治療提供新的思路和研究機制。

細胞鈣化；血管平滑肌細胞；鈣化模型；成骨細胞

如今心血管鈣化已成為普遍現(xiàn)象，許多心血管事件均與血管鈣化有關(guān)，如心肌梗死、瓣膜鈣化、夾層動脈瘤等疾病，這些疾病均有較高的致殘率和致死率。血管鈣化機制并沒有完全明確，普遍認為血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）對血管鈣化起著重要作用[1]，其作用機制及轉(zhuǎn)化分型對研究心血管疾病發(fā)病機制有著重要作用，因此對VSMCs鈣化后轉(zhuǎn)化類型研究有積極的意義。本研究中，對VSMCs進行體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)鈣化，旨在探討主動脈VSMCs鈣化后細胞轉(zhuǎn)化類型，為血管鈣化的機制及通路研究提供重要基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑

血管平滑肌原代細胞（廣州吉尼生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清、雙抗、胰酶（HyClone公司）；OPN單克隆抗體及過氧化物酶標記的抗鼠IgG（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；堿性磷酸酶檢測試劑盒、β-甘油磷酸鹽、茜素紅染色劑及其他試劑耗材（鄭州樂睿生物科技有限公司）。實驗主要依托單位河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室。

1.2方法

1.2.1VSMCs體外鈣化模型建立

原代血管平滑肌細胞置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)瓶，底面積＞80%并形成致密細胞層后開始傳代。將傳至第4代的細胞等量隨機分為實驗組和對照組，給予實驗組10 mmol/L的β-甘油磷酸鹽進行細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，給予對照組正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，換液1次/2 d，連續(xù)培養(yǎng)10天。

1.2.2堿性磷酸酶（ALP）測定

細胞棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞3次，取六孔板，每孔加入500μl 0.1%Triton X-100（0.9% NaCl制備），4℃過夜，反復(fù)吹打使細胞破碎，收集于離心管中，1200r/min離心3 min，收取上清，按ALP檢測試劑盒操作測定ALP活性。

1.2.3骨鈣素含量測定

將兩組細胞分別接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，換液1次/3 d，連續(xù)培養(yǎng)10天。留置實驗第0天和10天更換下來的細胞培養(yǎng)液，置-80℃保存。測量前先將500μL樣品干燥濃縮成粉狀，采用125I放射免疫法測量骨鈣素，具體方法按試劑盒說明進行。實驗重復(fù)2次。

1.2.4Western blot測定成骨細胞標志蛋白含量

收取兩組細胞，裂解后取上清液，測定蛋白濃度，進行濃度測定及定量后，95℃5 min變性，加入1/3體積的4×SDS上樣緩沖液，電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜膜上，5%無脂奶粉封閉，一抗為OPN單克隆抗體（1:500），孵育雜交過夜，洗膜后在過氧化物酶標記的抗鼠IgG中孵育1 h，漂洗后ECL顯色，曝光，掃描并分析。獨立實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1細胞鈣化

經(jīng)β-甘油磷酸鹽誘導(dǎo)鈣化后可見實驗組大量鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色后鈣化細胞呈紅色，并分布于整個細胞，對照組沒有附著紅色染料，實驗組細胞在鈣化誘導(dǎo)條件下有鈣鹽沉積，VSMCs鈣化模型建立成功。

2.2ALP檢測

兩組ALP活性均隨培養(yǎng)時間延長逐漸升高。實驗組ALP第10天明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　兩組ALP活性的變化（，n=8）

2.3骨鈣素含量

對照組中骨鈣素含量很低，而實驗組細胞骨鈣素含量持續(xù)升高，且明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　兩組細胞培養(yǎng)液上清骨鈣素含量變化（，n=8）

2.4成骨細胞標志物含量

Western blot顯示，實驗組OPN表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　兩組細胞OPN表達，*P＜0.05

3 討 論

血管鈣化是一個與骨調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白有關(guān)的主動調(diào)節(jié)過程，與臨床心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，課題組在前期查閱文獻后綜述示鈣化的形式類似于軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨；同時中膜自身的血管平滑肌細胞具有向成骨細胞轉(zhuǎn)化的潛能[2]。本研究在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過血管平滑肌體外細胞鈣化模型，研究細胞鈣化轉(zhuǎn)化類型，為心血管疾病認識提供新的思路和研究機制。

本實驗中細胞活性及其純度是鈣化誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵[3]。我們采用10 mmol/L β-甘油磷酸鹽作為誘導(dǎo)劑，β-甘油磷酸鹽能在短期內(nèi)誘導(dǎo)血管平滑肌細胞彌漫性鈣化，與體內(nèi)血管鈣化形式非常接近，β-甘油磷酸鹽是ALP的一種作用底物，在ALP的作用下分解產(chǎn)生無機磷酸鹽并以囊泡的形式分泌到胞外，與胞外基質(zhì)相互作用，形成鈣化點；而10 mmol/L β-甘油磷酸鹽能上調(diào)血管平滑肌細胞的ALP水平，促進鈣化[1]。而對鈣化的鑒定采用茜素紅染色，茜素紅能夠螫合鈣鹽，使鈣化細胞呈現(xiàn)紅色或者橘紅色。

研究發(fā)現(xiàn)，鈣化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是VSMCs向成骨樣細胞的轉(zhuǎn)分化，VSMCs在誘導(dǎo)條件下（如炎性因子、TGF-β和高密度脂蛋白等）均可轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泻铣珊头置诠δ艿某晒羌毎?，能合成和分泌多種骨形成蛋白，從而發(fā)生鈣化[4]。實驗組中成骨細胞標志物的ALP、OPN、骨鈣素含量在鈣化后含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明鈣化過程中出現(xiàn)細胞類型變化—VSMCs向成骨樣細胞轉(zhuǎn)化。其中ALP是一個成骨過程中的關(guān)鍵酶，是反應(yīng)成骨細胞成熟的標志性酶，其活性越高則提示成骨細胞的分化能力越強[5]；骨鈣素是體內(nèi)最豐富的非膠原類骨基質(zhì)蛋白，是骨細胞成熟的晚期標志之一，也是表示成骨細胞活性的一種特殊蛋白質(zhì)[1]，ALP和骨鈣素通常用作分子標記，以確定血管平滑肌細胞的早期表型轉(zhuǎn)化為成骨細胞樣細胞；而Yamaguchi[6]等研究發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白可影響血管鈣化的形成，但仍有一些學(xué)者在動脈粥樣硬化斑塊和鈣化的主動脈瓣中檢測到骨橋蛋白的表達[7]。

本研究說明在鈣化過程中存在VSMCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化的可能，對臨床心血管鈣化疾病的研究具有重要意義。但血管鈣化是一個復(fù)雜的過程，其機制仍需深入研究和探索。

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本文編輯：李淑雁

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ISSN.2095-6681.2015.18.186.03

劉 超，男，主任醫(yī)師，E-mail：liubeilun@sohu.com

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（No.14B310016）