張廷青 博士

1 問(wèn)題的提出

某新建奶牛場(chǎng)從澳大利亞辛辛苦苦引進(jìn)2 588頭育成牛，但兩年過(guò)去后卻始終有30頭無(wú)法受孕，未孕率為1.2%，這是目前較為準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。我曾工作過(guò)的飛鶴奶牛養(yǎng)殖公司以及提供技術(shù)服務(wù)的輝山乳業(yè)集團(tuán)和長(zhǎng)富乳業(yè)集團(tuán)亦存在一定比例的育成?？偸桥洳簧?。輝山乳業(yè)集團(tuán)大約為5%，長(zhǎng)富乳業(yè)集團(tuán)則是0.3%。管理比較好的華夏奶牛場(chǎng)在2008年進(jìn)口的2 800頭育成牛中，也有20余頭反復(fù)配種仍難受孕，不孕率為0.7%。以上這些不孕育成牛的體況發(fā)育、發(fā)情周期和生殖系統(tǒng)解剖形態(tài)及分泌物均正常，但就是長(zhǎng)期配種不受孕。理性分析，這種不孕很難歸咎于飼養(yǎng)管理不當(dāng)或繁殖技術(shù)員能力欠佳，因?yàn)橥褐械慕^大多數(shù)育成牛在同等條件下卻無(wú)受孕困難，均可及時(shí)受孕。在2010年青島中國(guó)奶牛發(fā)展大會(huì)，時(shí)任伊利牧業(yè)公司負(fù)責(zé)人的于飛曾當(dāng)面問(wèn)我:“為什么有些育成牛總是難以受孕?”我當(dāng)時(shí)的回答是:“如果育成牛未孕率低于5%，這屬于正常，是可以接受的;正如初婚少婦，大概總有低于5%者不能受孕，但迄今也難以闡述不孕機(jī)理?！碧孤实卣f(shuō)，這種回答只是陳述了客觀事實(shí)，并未觸及事物本質(zhì)。我當(dāng)時(shí)就對(duì)自己的答復(fù)感到難堪，自覺(jué)搪塞敷衍，十分不滿意。兩年以來(lái)，青島尷尬應(yīng)答一幕始終襲繞心頭，久難釋懷;加之征戰(zhàn)各奶牛場(chǎng)繁殖技術(shù)員如實(shí)陳述并殷切期望給予科學(xué)合理解釋，使我日感需盡早破解這一棘手難題。衷心感謝美國(guó)年輕女動(dòng)物繁殖科學(xué)工作者M(jìn)cDaneld博士的出色工作，其研究結(jié)果至少部分解答了為什么育成牛中總有1%～5%配不上的原因，以下我們嘗試?yán)斫馄溲芯克悸泛统醪桨l(fā)現(xiàn)。

2 發(fā)達(dá)國(guó)家的數(shù)據(jù)積累反映了什么?

限于篇幅，本文只列舉美國(guó)和英國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1)美國(guó)

美國(guó)自1963年至2003年，40年來(lái)奶牛群奶量提高了3259公斤，但與此同時(shí)，自1960年至2000年，空懷日亦增加了16.5天。鑒于此，美國(guó)農(nóng)業(yè)部的奶牛育種學(xué)家對(duì)2003年3月至2005年8月期間其家畜改良計(jì)劃實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)資料進(jìn)行了分析。這些資料來(lái)自全美41個(gè)州的2 668個(gè)奶牛場(chǎng)，涉及362 512頭育成牛的537 938次配種，系截至目前最大的奶牛育成牛繁殖資料樣本，有一定說(shuō)服力。表1概括了配種次數(shù)與情期受胎率的關(guān)系。需要說(shuō)明的是，超過(guò)7次配種的育成牛資料被剔除，這些育成牛的總頭數(shù)大概占全部配種數(shù)據(jù)的0.25%。

表1 配種次數(shù)與情期受胎率的關(guān)系

配種次數(shù)與情期受胎率的關(guān)系一目了然，無(wú)需贅述。有心的同道會(huì)問(wèn):為什么有些育成牛配種5次仍難受孕?

2)英國(guó)

5年前，英國(guó)在19家奶牛場(chǎng)對(duì)影響育成牛留養(yǎng)率和繁殖率的若干因素進(jìn)行了分析和歸納，其中表2的某些結(jié)果與本文密切相關(guān)。

表2 自配種至首次分娩產(chǎn)奶，各階段育成牛損失率及死亡原因總結(jié)

此表雖然提供了較多信息，以及如何提高奶牛群體整體繁殖效率各關(guān)鍵控制節(jié)點(diǎn)，但同道們只需注意用黑體編注的妊娠育成牛一欄。該欄清楚表明:育成牛的不孕率為3%。

簡(jiǎn)言之，上述英美兩個(gè)國(guó)家的統(tǒng)計(jì)資料毫無(wú)懸念的證實(shí):在發(fā)達(dá)國(guó)家，如同中國(guó)一樣，依然有1%～5%的育成牛屢配不孕!那么，如何藉用現(xiàn)代高科技應(yīng)對(duì)這一實(shí)實(shí)在在的挑戰(zhàn)呢?

3 McDaneld博士是如何破解這一難題呢?

眾所周知，繁殖性狀的遺傳力是非常低的，大約在0.04～0.16之間。因此，如欲在龐大總體中準(zhǔn)確篩選出基因組區(qū)域具有低生育力遺傳標(biāo)記的個(gè)體，無(wú)疑大海撈針。加之，與繁殖效率相關(guān)的個(gè)體基因位點(diǎn)本身就非常微妙精細(xì)，如果采用一對(duì)一的辦法進(jìn)行逐一個(gè)體分析，即使有愚公移山的精神，曠日持久的努力亦難實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。鑒于此，McDaneld博士采用分組合并血樣的辦法解決，即將不同生育力組育成牛個(gè)體血樣合并一起做相似個(gè)體同組分析。對(duì)生育力分組的定義如下:

A.生育力好:兩年配種均妊娠。

B.生育力一般:兩年配種僅有一年妊娠。

C.生育力差:兩年配種均未妊娠。

McDaneld博士采集生育力差育成牛血樣并合并提取DNA(脫氧核糖核酸)的工作概述如下。

1)采集生育力差育成牛血樣并提取DNA。

這一工作主要是在肉牛品種完成，總共涉及7 078頭肉母牛，表3是部分?jǐn)?shù)據(jù)。

表3 各生育力組育成牛血樣采集基本資料

2)應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記法(SNP Marker Assay)。

McDaneld博士的第二步工作是:應(yīng)用超過(guò)700 000的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記法(其中相當(dāng)數(shù)量的單核苷酸多態(tài)性存在于Y染色體區(qū)域)對(duì)表3的各組代表性樣品進(jìn)行分析，嘗試鑒別與影響繁殖效率相關(guān)的基因組變異區(qū)域。令人意外的是:從生育力差組獲得的熒光強(qiáng)度介于正常母牛和公牛之間，這間接證實(shí):生育力差組中至少某些育成牛個(gè)體的基因型很可能含有Y染色體區(qū)域的若干基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):Y染色體上的1 224個(gè)單核苷酸多態(tài)性，有550個(gè)存在于生育力差育成牛組的基因型內(nèi)。同時(shí)，生育力好組和生育力一般組獲得的熒光強(qiáng)度均在預(yù)期值范圍內(nèi)，說(shuō)明這兩組育成牛個(gè)體的基因型不可能含有Y染色體區(qū)域的若干基因。

3)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real Time-PCR=QRT-PCR)技術(shù)。

McDaneld博士的第三步工作是:應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)確定生育力差育成牛組基因型內(nèi)存在Y染色體的某些片段。表4共列出QRT-PCR的8對(duì)引物，其中GAPDH基因引物是用來(lái)監(jiān)控樣品DNA的質(zhì)量和含量;Y_SNP_1、Y_SNP_2、Y_SNP_3、Y_SNP_4、Y_SNP_5和Y_SNP_6等6對(duì)引物則分別擴(kuò)增Y染色體對(duì)應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性1、2、3、4、5和6。Bov_Y引物擴(kuò)增產(chǎn)物以往可用來(lái)確定胚胎性別，此次研究中使用是為了確定生育力差育成牛組基因型內(nèi)是否存在Y染色體片段。表4最后一列為擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基對(duì)數(shù)量。對(duì)總數(shù)319頭2年配種未孕的育成牛DAN應(yīng)用QRT-PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果是:含有Y染色體片段陽(yáng)性者比率高達(dá)21%～29%!經(jīng)驗(yàn)豐富并細(xì)心的讀者會(huì)詰問(wèn):妊娠早期雙胎中死亡的雄性胚胎會(huì)誤導(dǎo)人們以為存活至足月分娩的雌性胚胎為正常母犢而非異性孿生母犢，McDaneld的檢測(cè)結(jié)果是否確定出了分娩時(shí)未發(fā)見的異性孿生母犢?回答是否定的，因?yàn)榇罅拷y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示:妊娠42日之前，雙胎中死亡其中一個(gè)胚胎的發(fā)生率僅為6%。那么，究竟為什么兩年配種未孕育成牛中有21%～29%個(gè)體攜帶Y染色體的部分片段呢?目前尚未破解其機(jī)理，人們只是推測(cè)在配子生成過(guò)程期間，性染色體單體相互交換時(shí)可能發(fā)生了Y染色體某些片段的錯(cuò)位或移位。

表4 QRT-PCR 8對(duì)引物的序列結(jié)構(gòu)

圖1清楚顯示:12頭2年配種未孕育成牛中至少有8頭攜帶Y染色體部分片段(3、4、5、6、7、8、9和12);Bull=公牛DNA;Cow=母牛DNA。A圖為應(yīng)用Bov_Y引物擴(kuò)增結(jié)果;B圖為應(yīng)用Y染色體單核苷酸多態(tài)性1引物擴(kuò)增結(jié)果。兩圖中公牛均呈陽(yáng)性，說(shuō)明Y染色體基因組完整;但A圖中的被檢測(cè)育成牛陽(yáng)性者在B圖并未全部呈陽(yáng)性，說(shuō)明這些2年配種未孕的育成牛只是攜帶了Y染色體的部分片段。

圖1 12頭2年配種未孕育成牛應(yīng)用Bov_Y引物(A圖)和Y染色體單核苷酸多態(tài)性1引物(B圖)擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

4 McDaneld博士是否真的破解了奶牛育成牛中總有1%～5%難以受孕這一棘手難題呢?

圖2 McDaneld博士

McDaneld博士(圖2)的研究思路和設(shè)計(jì)無(wú)疑是獨(dú)具匠心的，其研究結(jié)果的確對(duì)探索奶牛育成牛不孕癥病因和指導(dǎo)臨床防治工作提供了新的思路。肉牛育成牛生育力差的情形與奶牛育成牛有相似處，McDaneld博士的發(fā)見亦可用來(lái)推測(cè)生育力差的奶牛育成牛也極可能存在類似現(xiàn)象。不過(guò)，這仍需在奶牛方面開展這項(xiàng)研究，藉以獲得真實(shí)證據(jù)。因此，從嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度來(lái)說(shuō)，目前我們還不能斷然下結(jié)論:1%～5%奶牛育成牛難以受孕的棘手難題業(yè)已徹底破解。對(duì)現(xiàn)場(chǎng)工作者而言，讀懂或完全理解本文需要具有最基本的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)。撰寫本文初始，我已預(yù)感到同道們會(huì)感到困惑。也許，McDaneld博士發(fā)表其研究結(jié)果時(shí)采用如下的英文標(biāo)題能使同道們記住本文的要旨:

“Y are you not pregnant:Identification of Y chromosome segments in female cattle with decreased reproductive efficiency.”翻譯過(guò)來(lái)是:“為什么您未妊娠?確定生育力差育成牛攜帶Y染色體片段。”英文標(biāo)題中的“Y”用得非常妙!“Y”的發(fā)音相似于“Why”，所以:“Y” =“Why(為什么)” =Y染色體，畫龍點(diǎn)睛、一字?jǐn)?shù)意，便于理解和記憶!

下期我們討論為什么獸醫(yī)繁殖人員應(yīng)合二為一，實(shí)行幷崗?