張譯捷，王智鋒，陳文彬，李 杏，楊珍珍，杜玉濤

(深圳華大方舟生物技術有限公司，廣東 深圳518083)

動物轉基因技術是一種應用于實驗生物學和應用生物學強有力的工具［1］。這種技術使得人們在生物體內(nèi)直接研究基因相應的功能、調(diào)控作用，以及其在正常狀態(tài)和疾病發(fā)生過程中的作用機制成為現(xiàn)實［2～4］。轉基因技術構建的相關人類疾病的動物模型，使科學家能夠清楚地認識相關疾病對應的遺傳學和分子機制，從而能夠開發(fā)出對應的疾病治療方案以及設計出對應的藥物靶點［5～8］。

原核顯微注射法是目前應用最廣泛的制備轉基因小鼠技術，該方法操作較簡單，容易得到完全整合的小鼠，并且得到的轉基因動物大多數(shù)可以傳代［9］，但是存在獲得轉基因小鼠效率較低的問題。外源DNA 濃度是影響轉基因小鼠制備效率的主要因素之一［10］。因此原核顯微注射中，選擇最佳的外源DNA 濃度對科研、生產(chǎn)都非常重要。另外，小鼠品系也是影響轉基因效率的因素之一［11］。在Anna B 文章中顯示，采用C57/BL6 小鼠制備轉基因小鼠效率較KM 小鼠低［11］。鄭敏等報道，低濃度的外源DNA 注射液有利于提高轉基因小鼠的制備效率，但只針對特定的DNA 長度［12］，且采用KM 小鼠為實驗對象，實驗數(shù)據(jù)不足以對C57/BL6小鼠提供參考。本實驗采用C57/BL6 小鼠進行實驗優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與材料

試劑: 孕馬血清促腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺素(hCG) 購于寧波第二激素廠; 透明質(zhì)酸酶、M2、M16 培養(yǎng)基、礦物油均購于Sigmar 公司;酶切產(chǎn)物的純化試劑盒購于Omega 公司。

儀器與主要耗材: 體式顯微鏡、倒置顯微鏡購于Nikon 公司; 顯微注射系統(tǒng)購于Eppendorf 公司;拉針儀、煅針儀分別購于Sutter 公司、Narishige 公司; 原核注射針、持卵針、胚胎移植針均為自制;培養(yǎng)皿及操作盤均購于Becton Dickinson 公司。

1.2 實驗動物

供體鼠為4 ～6 周齡C57/BL6 小鼠; 結扎公鼠、受體母鼠皆為KM 小鼠，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 外源DNA 的制備

將質(zhì)粒DNA 擴增后，酶切線性化，用凝膠回收法純化后融于無菌的TE 緩沖液中，稀釋至相應濃度，置于-20 ℃保存等待注射。

1.3.2 供體鼠、結扎公鼠、受體鼠的制備

動物飼養(yǎng)室的光照時間調(diào)節(jié)為5: 00-19: 00，19: 00 至次日5: 00 為夜晚。

對4 ～6 周齡的C57/BL6 雌性小鼠注射10 IU PMSG，48 h 后注射10 IU hCG，與C57/BL6 雄性小鼠合籠交配，收集有陰道栓的小鼠; 對4 周齡以上的具有生殖功能的KM 雄性小鼠進行麻醉，通過外科手術將其輸精管剪斷，縫合后，靜養(yǎng)4 周，與母鼠合籠制備受體母鼠; 選4 周齡以上的KM 雌性小鼠與結扎公鼠合籠，次日收集見栓的雌性小鼠，進行胚胎移植。

1.3.3 受精卵的收集及處理

對有陰道栓的C57/BL6 雌性小鼠人道處死，剖腹，取卵巢及部分子宮角。取出的組織用M2 清洗，放置在新的M2 溶液中，在體式顯微鏡下，用利器劃開輸卵管，使受精卵從輸卵管中流出。用移液器將帶顆粒細胞的受精卵轉至1 mg/mL 透明質(zhì)酸酶中消化去除顆粒細胞。在M2 操作液中清洗若干次后，挑選有2 個原核、形態(tài)良好的受精卵，轉至M16 培養(yǎng)液放于37 ℃、5% CO2、5% O2、飽和濕度培養(yǎng)箱中待用。

1.3.4 顯微注射

取20 ～30 枚受精卵于注射盤內(nèi)，對較大原核(雄原核) 進行注射，見到原核體積明顯增大原來1/3 才算成功注射。若受精卵原核無明顯增大，說明外源DNA 注射液未注入原核中，此類注射為無效注射。注射完畢，將注射后存活的受精卵轉至M16 培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5% CO2、5% O2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)30 ～60 min 后移植［13］。

1.3.5 胚胎移植

取同日見栓的受體鼠，麻醉后通過外科手術在腹部側位取出卵巢，用鑷子撕破卵巢漿膜，找到輸卵管壺腹部，吸有25 枚左右注射后胚胎的移植針插入其中，將胚胎移植入輸卵管內(nèi)，后將卵巢、輸卵管送回受體鼠體內(nèi)，縫合［13］。

1.3.6 基因型分析

小鼠出生10 d 后，剪小鼠腳趾及鼠尾抽提基因組DNA，進行PCR 分析，鑒定轉基因陽性小鼠。

2 結果

在9 個片段大小不同的實驗組中，相同外源DNA 片段濃度為2.5 ng/μl 實驗組在小鼠懷孕率、出生率、F0 小鼠陽性率上，結果普遍比5.0 ng/μl實驗組高(見表1)，總效率均高于5.0 ng/μl 實驗組(見圖1)。從圖1 中可看到，外源DNA 長度對制備轉基因小鼠效率無線性相關性，濃度的變化影響轉基因小鼠制備的效率。

排除了外源DNA 片段長度對轉基因效率的影響，研究外源DNA 濃度變化對轉基因效率的影響，2.5 ng/μl 實驗組在小鼠懷孕率(55.2%∶39.8%)、出生率(10.8%∶7.13%)、陽性率(12.4%∶8.53%)、總 效 率(1.17% ∶0.54%) 等結果均顯著高于5.0 ng/μl實驗組(見表2)。2.5 ng/μl DNA 實驗數(shù)據(jù)在懷孕率、出生率、陽性率、總效率比5.0 ng/μl DNA 注射液結果顯著提高。

圖1 不同DNA 片段大小的轉基因小鼠制備效率

3 討論

目前通過原核注射的方法制備轉基因小鼠，仍是廣泛應用的轉基因技術。顯微注射法可以直接對大分子DNA 片段進行操作，容許對轉基因表達載體進行充分優(yōu)化［10］。但影響顯微注射法制備轉基因小鼠效率的因素較多［14］，如小鼠品系、DNA 濃度、DNA 片段的狀態(tài)及注射針等，因此對顯微注射法制備轉基因小鼠進行優(yōu)化，仍有重要的意義。

表1 不同大小片段的DNA 顯微注射結果

表2 兩種濃度的DNA 顯微注射結果

DNA 的濃度對轉基因小鼠的研制效率有較大影響［15］。DNA 濃度過高，小鼠胚胎注射后的存活率較低，從而降低轉基因小鼠的制備效率; DNA濃度過低，轉基因小鼠的陽性率較低，甚至得不到轉基因小鼠［10］。本實驗采用C57/BL6 小鼠為實驗對象，對原核期受精卵注射2.5 ng/μl DNA 溶液，懷孕率、出生率、陽性率、總效率均有顯著的提高。參考Anna B 的分析，C57/BL6 小鼠雖是常用的轉基因供體小鼠，但該品系獲得的轉基因小鼠效率較其他品系低［11］，可能原因是DNA 注射液對胚胎而言是外來物，對胚胎有輕微的毒性，C57/BL6小鼠胚胎對外源物質(zhì)更為敏感。對C57/BL6 品系小鼠而言，2.5 ng/μl 的DNA 溶液更適合注射。該結果與鄭敏等人的結果一致，但與外源DNA 長度無較大相關性。

本實驗在對不同大小DNA 片段注射結果中發(fā)現(xiàn)，轉基因小鼠制備效率與DNA 片段大小未呈現(xiàn)負相關，結果與池駿等人的結果不同［16］。DNA 片段長度并不是影響轉基因小鼠制備效率的主要因素，在注射相同片段DNA 的結果中，濃度是影響轉基因小鼠制備效率的主要因素。

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