張 雪，陳格飛，孟 清

(東華大學 生物科學與技術研究所，上海 201620)

大腹園蛛主壺腹腺絲基因的篩選及序列分析

張 雪，陳格飛，孟 清

(東華大學 生物科學與技術研究所，上海 201620)

為研究蛛絲蛋白編碼基因和蛋白的組成結構模式、進化，并為蛛絲仿生提供更多的基因資源，運用3D/PCR(three -dimensional polymerase chain reaction)技術對大腹園蛛(A.ventricosus)Fosmid基因組文庫進行主壺腹腺絲(MaSp1)編碼基因的篩選，并對部分序列進行分析.通過篩選實驗室前期構建的Fosmid文庫獲得含有MaSp1基因的陽性克隆Av11-19-5，通過shotgun測序得到MaSp1部分基因序列MaSp1RC.MaSp1RC長786 bp，編碼的262個氨基酸(AvMaSp1RC)可劃分為保守的 C端非重復區(qū)(CT)和重復區(qū)(Rep).Rep主要由poly-Ala，Glyx和GlyGlyx等模塊組成，Ala和Gly含量占總氨基酸的78%；CT中參與形成離子鍵的氨基酸及helix 4上的疏水模塊高度保守.研究結果為蛛絲蛋白二聚化及仿生學研究提供了更多的基因資源.

大腹園蛛；主壺腹腺絲蛋白；3D/PCR技術；序列分析

蜘蛛絲(spider silk)是一種生物可降解的高分子蛋白纖維，其理化性質及力學性能均優(yōu)于現(xiàn)有的人造合成材料，因而，其在國防、軍事、建筑、醫(yī)療和紡織等領域具有廣闊的應用前景，成為仿生學研究的重要目標[1-5].圓網(wǎng)蛛可分泌6種絲纖維和一種黏液蛋白，分別扮演不同的生物學角色，如捕捉和黏合獵物、編織卵袋、固定連接等[6].主壺腹腺分泌的主壺腹腺絲(MaSp)構成整個蛛網(wǎng)的主干，以其高強度和高彈性而備受關注.20世紀90年代，國內(nèi)外學者開始蛛絲蛋白基因的克隆研究，但至今蛛絲基因及蛋白序列的結構模式還沒有解析完全[7-8].文獻[9]證實Nephilaclavipes和Nephilamadagascariensis鞭毛狀絲蛋白(Flagelliform，F(xiàn)lag)編碼基因中含有13個大小均勻的內(nèi)含子，轉錄子大小約為15.5kb；文獻[10]報道了Argiopetrifasciata(A.trifasciata)主壺腹腺絲(major ampullate spidroin，MaSp)蛋白2亞基部分基因序列，與Flag編碼基因結構相似，A.trifasciataMaSp2也含有多個大小一致的內(nèi)含子.文獻[11]報道了Latrodectushesperus(L.hesperus)MaSp1/2全長編碼基因序列，證實L.hesperusMaSp1/2編碼基因均由一個較為罕見的開放閱讀框架組成，MaSp1/2基因大小分別約為11和10kb.文獻[12]報道了大腹園蛛(Araneusventricosus，A.ventricosus)次壺腹腺絲(minor ampullate spidroin，MiSp)蛋白全長編碼基因，該基因與文獻[9-11]的基因模式均不相同，含有一個5.6 kb的基因內(nèi)含子.文獻[13]證實L.hesperus葡萄狀絲(Aciniform spidroin，AcSp)全長編碼基因序列只含有一個19 kb的開放閱讀框架.另外，文獻[14]通過PCR( polymerase chain reaction)的方法初步確定Argiopeargentata(A.argentata)和L.hesperus管狀絲蛋白(Tubuliform spidroin，TuSp)編碼基因不含有基因內(nèi)含子.上述基因結構模式表明蛛絲蛋白編碼基因具有進化多樣性，但迄今為止，僅有3條全長基因序列：L.hesperusMaSp1/2、A.ventricosusMiSp和L.hesperusAcSp[11-13]，還不足以對蛛絲蛋白編碼基因及蛋白的結構模式進行系統(tǒng)性分析.另外，蛛絲基因的克隆進展緩慢，嚴重阻礙了蛛絲仿生的研究，現(xiàn)階段，蛛絲蛋白的表達主要為蛛絲模塊的串聯(lián)體，仿生的擬蛛絲纖維性能遠不及天然蛛絲.

大腹園蛛為蛛形綱蜘蛛目園蛛屬節(jié)肢動物，網(wǎng)較大且絲性能突出，在我國分布廣泛.為進一步研究蛛絲蛋白編碼基因和蛋白的組成結構模式，并為仿生學提供更多的基因資源，本文以前期構建的無偏向性、覆蓋倍數(shù)高的A.ventricosusFosmid 基因組文庫為基礎[15]，利用3D/PCR(three-dimensional polymerase chain reaction)篩選方法對文庫進行MaSp1編碼基因的篩選，得到含有MaSp1編碼基因的陽性克隆，并進行shotgun測序，從而對獲取的部分MaSp1序列進行分析和討論.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

A.ventricosus采集于上海松江周邊地區(qū)，液氮速凍后-80℃保存；大腹園蛛基因組文庫由實驗室保存；Taq DNA 聚合酶(Vazyme公司，美國)；QIprepTMSpin Miniprep Kit(Qiagen,德國)；AxyprepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen,美國)；CopyControlTMHTP Fosmid Library Production Kit(Epicentre，美國).

1.2 方法

(1) 引物的設計.根據(jù)NCBI(national center for biotechnology information)Genbank收錄的有關蜘蛛MaSp的C端氨基酸序列Blast分析，確定MaSp的C端非重復區(qū)(CT)保守氨基酸序列，設計引物(如表1所示)，并由上海生工生物工程技術服務有限公司(簡稱上海生工)測序合成.

表1 引物序列Table 1 Primers

(2)A.ventricosus基因組的提取及標簽序列的獲取.以A.ventricosus胸部肌肉組織為原料，采用改良CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide)法提取高相對分子質量基因組DNA(high molecular weight genome DNA,HMW-gDNA)[16]，以引物MaSp-up和MaSp-down對基因組DNA進行擴增，循環(huán)條件為95℃預變性5min，94℃變性30s，65℃ 退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)為30，終始延伸10min.對目的條帶進行切膠回收，送上海生工測序.經(jīng)過條件優(yōu)化得到257 bp的DNA片段，測序后進行NCBI BlastN 同源序列比對確定此序列為A.ventricosusMaSp C端非重復區(qū)部分序列，并確定該序列為標簽序列進行文庫篩選.

(3) 文庫的篩選.采用3D/PCR法篩選A.ventricosusFosmid基因組文庫:①超級混合池(混合池的構建詳見文獻[15])的菌種接種于5mL含12.5μg/mL氯霉素的LB( Luria-Bertani)培養(yǎng)基中，37℃，180r/min過夜培養(yǎng)，提取混合質粒進行PCR篩選，對目的條帶切膠回收測序，以確定其中是否存在一個或多個陽性克??；②確定超級混合池的混合質粒中存在的陽性克隆后，抽提一級混合池和二級混合池質粒，分別進行PCR篩選；③陽性克隆存在的批次通過超級混合池的篩選來確定，陽性克隆存在的384-well plates的編號由一級混合池可以確定，陽性克隆存在的行列交叉位置根據(jù)二級混合池篩選確定，由此確定陽性克隆的具體位置.用引物MaSp-repeat和MaSp-down進一步驗證陽性克隆.

(4) Fosmid陽性單克隆高拷貝誘導及末端測序鑒定.在15mL試管中加入4.5mL新鮮LB培養(yǎng)基(含12.5μg/mL氯霉素)、500μL過夜活化菌液和5μL Copycontrol Induction Solution，配成理想的誘導體系，37 ℃，180r/min振蕩培養(yǎng)5h，誘導Fosmid陽性單克隆質粒的高拷貝，整個過程需保證通氣性良好，抽提重組pCC2FOSTM載體.將提取高拷貝單克隆pCC2FOSTM重組載體，以End-F和End-R為引物，送上海生工對陽性克隆進行Fosmid末端測序.

(5) 序列分析.通過末端測序鑒定插入目的片段的完整性，對包含目的基因的陽性克隆送上海生工進行shotgun測序.利用DNAman、SerialCloner 2-6-1、Clustal Omega、PSIPRED v3.3(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)以及MEGA 4.0對當前已獲取的部分序列進行分析.

2 結果與分析

2.1 基因組提取、PCR擴增及陽性克隆的篩選鑒定

利用改良CTAB法提取A.ventricosus基因組DNA(如圖1(a)所示)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因組DNA彌散性小，大片段較為集中.以基因組DNA為模板,MaSp-up和MaSp-down為引物進行MaSp C端蛋白基因PCR擴增，經(jīng)過優(yōu)化PCR條件和體系，得到特異性高的PCR產(chǎn)物(如圖1(b)所示)，位于200～300bp.回收該片段進行測序分析，測序結果經(jīng)比對證實為A.ventricosusMaSp1C端基因序列.以該片段作為MaSp1編碼基因的標簽序列對文庫進行篩選，如圖1(c)所示，在11號超級混合池中篩選得到陽性條帶，并通過進一步篩選相應的一級/二級混合池得到陽性克隆Av11-19-5，約為40kb.Av11-19-5經(jīng)Fosmid末端引物測序分析確定該克隆含有A.ventricosusMaSp1編碼基因.

圖1 大腹園蛛基因組、PCR以及文庫篩選凝膠圖譜Fig.1 Agarose gel figures of A.ventricosus genome，PCR and library screening

2.2 AvMaSp1RC氨基酸序列分析

對陽性克隆Av11-19-5進行shotgun測序得到多個MaSp1片段，將包含部分重復區(qū)和C端非重復區(qū)的片段命名為MaSp1RC.MaSp1RC長786 bp，預編碼262個氨基酸(AvMaSp1RC).AvMaSp1RC可劃分為重復區(qū)(Rep)和C端非重復區(qū)(CT，110個氨基酸殘基)(圖2).AvMaSp1RC重復區(qū)主要由甘氨酸(Glycine，Gly)和丙氨酸(Alanine，Ala)組成，約占總氨基酸含量的78%(如圖3(a)所示)，主要以GlyGlyx，Glyx(x為其他氨基酸)和poly-Ala典型的蛛絲蛋白模塊形式存在.AvMaSp1RC非重復區(qū)絲氨酸(Serine，Ser)、Ala和纈氨酸(Valine，Val)、亮氨酸(Leucine,Leu)(大約占67%,如圖3(b)所示)含量較高.對AvMaSp1RC中含量相對較高的4種氨基酸(Ala，Ser，Gly，Gln)進行密碼子偏愛性分析，結果如圖4所示.由圖4可以看出，密碼子第三位腺嘌呤(Adenine，A)和胸腺嘧啶(Thymine，T)占主要優(yōu)勢，鳥嘌呤(Guanine，G)和胞嘧啶(Cytosine，C)使用頻率較低.

利用PSIPRED對AvMaSp1RC CT二級結構進行預測，AvMaSp1RC CT主要由5個α-helix組成(圖2)，其中最長的helix 4呈現(xiàn)高疏水性(圖5，氨基酸位置為213～233).AvMaSp1RC重復區(qū)由于重復性高，親疏水性呈周期性變化，分布均勻.

圖2 MaSp1RC序列及編碼氨基酸Fig.2 MaSp1RC gene sequence and amino acids

圖3 AvMaSp1RC重復區(qū)和非重復CT氨基酸組成分析Fig.3 Amino acid composition of AvMaSp1RC Rep and CT domains

圖4 AvMaSp1RC高頻氨基酸密碼子偏愛性分析Fig.4 Codon preference of high-frequency amino acids predicted from AvMaSp1RC

圖5 AvMaSp1RC親疏水性分析Fig.5 Kyte -Doolittle hydrophobicity plot for AvMaSp1RC

2.3 AvMaSp1同源性分析

利用Clustal Omega對AvMaSp1RC與NCBI收錄的其他多種蛛絲蛋白C端序列進行序列比對分析，結果如圖6所示.由圖6可以看出，AvMaSp1RC與其他的蛛絲蛋白C端氨基酸序列保守性較高，其中精氨酸(Arginine，Arg)、天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)、谷氨酸(Glutamic acid，Glu)以及賴氨酸(Lysine，Lys)呈高保守(圖6中矩形框).另外，MiSp和MaSp的CT結構域中QALL模塊以及MaSp的CT中的半胱氨酸(Cysteine，Cys)也高度保守.

圖6 AvMaSp1RC CT與NCBI收錄的多條蛛絲蛋白C端序列比對Fig.6 Amino acid alignment of AvMaSp1RC CT with different spidroin CT domains deposited in NCBI

圖7 AvMaSp1RC系統(tǒng)進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of AvMaSp1RC

利用NCBI中的Protein Blast對C端序列進行同源性分析，結果顯示AvMaSp1RC CT與多條MaSp CT序列具有較高的一致性，其中與Argiopeamoena(A.amoena)MaSp1CT一致性高達92%，與A.trifasciataMaSp1CT一致性達85%，與Argiopebruennichi(A.bruennichi)的一致性也高達83%，除此之外，還與其他數(shù)種蜘蛛絲的相似性達70%以上.利用MEGA V4.0對NCBI上選取的多種蛛絲蛋白C端氨基酸序列(A.trifasciataMaSp2，A.bruennichiMaSp1，N.clavipesFlag，L.hesperusMiSp，U.diversusMiSp，L.hesperusAcSp1，A.ventricosusAcSp，A.argentataTuSp1，A.apertaTuSp1，A.gulosusfibroin1，P.tristisfibroin1，A.trifasciataPySp，L.hesperusPySp.)繪制同源蛋白進化樹，結果如圖7所示.由圖7可以看出，AvMaSp1RC與A.trifasciataMaSp2，A.bruennichiMaSp1位于同一節(jié)點，屬于同一個基因家族，與Flag,AcSp,TuSp和PySp屬于不同的基因家族.

3 討 論

蛛絲纖維由高相對分子質量的蛛絲蛋白組成，如主壺腹腺絲主要由MaSp1和MaSp2兩個亞基組成，鞭毛狀絲則由Flag單個亞基組成，次壺腹腺絲由MiSp1和MiSp2組成等[7-9,11,17].雖然蛛絲蛋白組成成分各不相同，但初級結構較為相似，均由N端和C端非重復區(qū)以及重復區(qū)組成，其中NT和CT可調節(jié)蛛絲蛋白的纖維化，而Rep則與絲纖維的性能相關[11-13,18-20].組成MaSp，MiSp以及Flag Rep的主要模塊為polyA/GA，GGx，GPGGx/GPGQQ以及Spacer.polyA/GA可形成緊密的β-sheet晶體結構，與纖維軸向平行，賦予纖維強度；GPGGx/GPGQQ形成β-spiral結構，與纖維良好的延展性相關；GGx模塊則主要形成31-helix，連接晶態(tài)區(qū)域；Spacer功能尚不明確[12,13,21-24].主壺腹腺絲蛋白主要由polyA，GGx和GPGQQ組成，次壺腹腺則主要由polyA/GA，GGx及Spacer組成，由于GA形成的β-sheet晶體結構不如polyA形成的β-sheet晶體結構穩(wěn)定，因此次壺腹腺絲較主壺腹腺絲強度弱[22].鞭毛狀絲蛋白不含polyA，力學強度遠小于主/ 次壺腹腺絲，但由于連續(xù)出現(xiàn)的GPGGx模塊含量高，因此鞭毛狀絲具有最好的彈性(> 200%)[9,25].由于主壺腹腺絲擁有強度和彈性的完美結合且分泌腺易于分離，長期以來一直為蛛絲蛋白研究及仿生領域的焦點.但是由于主壺腹腺絲蛋白編碼基因長、重復性高等，阻礙了全長MaSp編碼基因的克隆.由于全長基因序列報道有限，蛛絲蛋白的基因以及蛋白結構的研究尚不明確，也無完整蛛絲蛋白的表達研究，現(xiàn)階段的表達和仿生均是嘗試對蛛絲蛋白模塊串聯(lián)體的表達，獲取的擬蛛絲纖維性能遠不及天然蛛絲.為明確蛛絲基因和編碼蛋白的結構模式，并為表達仿生研究提供更多的基因資源，本文以實驗室前期構建的A.ventrisosus基因組文庫為基礎[15,26]，結合3D/PCR方法篩選MaSp1編碼基因，并對通過shotgun測序獲取的部分序列進行分析.

AvMaSp1RC Rep主要由典型的蛛絲蛋白模塊GlyGlyx和poly-Ala組成，由于AvMaSp1RC Rep缺少MaSp2的特征序列GlyProGlyxx，將其劃分為MaSp1家族.AvMaSp1RC Rep與L.hesperusMaSp1Rep較為相似，poly-Ala較長，由6～9個丙氨酸構成.Ala和Gly是組成AvMaSp1RC Rep的主要氨基酸，占78%左右(圖3)，而在L.hesperusMaSp1和A.ventricosusMiSp重復區(qū)中，這兩種氨基酸也分別約占68%[11-12].由于蛛絲蛋白的重復區(qū)占整個蛋白的95%以上，因此Gly和Ala是構成蛛絲蛋白的主要氨基酸.編碼Gly和Ala的密碼子前兩位主要為G或者C，為了減少GC的使用率，防止mRNA形成特殊的二級結構，與L.hesperusMaSp1和A.ventricosusMiSp相似，Gly和Ala密碼子的第三位堿基主要為A或者T，減少了G和C的使用率(圖4)[11-12].但在關于悅目金蛛管狀腺絲蛋白基因報道中，含量較高的Ser和Gly并未出現(xiàn)明顯的密碼子偏愛性，說明不同種蜘蛛的不同種蛛絲蛋白在密碼子的使用上存在差異[27].

蛛絲蛋白由NT、CT和重復區(qū)組成，絲性能主要由重復區(qū)氨基酸決定，非重復末端NT和CT則主要參與絲素蛋白纖維化的調節(jié)及成絲過程，保守性高[20,28].通過對AvMaSp1RC CT與部分已知蛛絲蛋白CT的比對分析，發(fā)現(xiàn)Arg，Asp，Glu以及Lys在參與比對的蛛絲蛋白CT中高度保守，保守的Arg，Asp以及Glu可參與鹽鍵的形成，通過感應pH值的變化控制CT蛋白的穩(wěn)定性[19,29].研究發(fā)現(xiàn)QALL模塊在MiSp和MaSp CT中高度保守，該區(qū)域疏水性高，位于α-helix 4中，推測這種疏水作用與CT的二聚化有關.另外，MaSp中還擁有保守的Cys，研究表明Cys可以形成鏈間二硫鍵，促進穩(wěn)定CT二聚體的形成[19].MiSp CT主要通過輸水作用和離子鍵形成二聚體，而MaSp CT通過二硫鍵、疏水作用以及離子鍵形成更加穩(wěn)定的二聚體，可能與主壺腹腺絲的高強度相關.研究表明，MiSp的CT模塊可溶性較MaSp CT好，可在常溫下保存和操作，MaSp CT則容易發(fā)生聚集現(xiàn)象，此現(xiàn)象的具體機制尚不明確[29].AraneusdiadematusMaSp 和NephilaantipodianaMiSp CT主要由5個α-helix組成[19,29]，因此，利用PSIPRED對AvMaSp1RC CT進行了二級結構預測，AvMaSp1RC CT與上述的CT末端二級結構相似，二級結構主要也為5個α-helix.

系統(tǒng)進化樹表明，AvMaSp1RC與A.trifasciataMaSp2和A.bruennichiMaSp1位于同一節(jié)點之內(nèi)，為MaSp蛋白家族新成員.本文研究為蛛絲蛋白編碼基因的結構模式以及蛛絲蛋白二聚化研究提供基礎，為仿生學的研究提供了更多的基因資源;同時，也為本課題組目前正在開展的利用Intein(蛋白質內(nèi)含子)剪接合成長片段蛛絲蛋白以及后續(xù)的人工紡絲提供了資源，為蜘蛛絲的深入研究和開發(fā)打下了良好基礎，期望利用此基因序列表達出性能更為優(yōu)良的蛛絲蛋白，并進行細胞培養(yǎng)等方面的實驗，進而應用于醫(yī)學、軍事等多領域的研究.

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Screen and Sequence Analysis of Major Ampullate Spidroin Gene-1fromAraneusVentricosus

ZHANGXue,CHENGe-fei,MENGQing

(Institute of Biological Science and Biotechnology,Donghua University,Shanghai 201620,China)

To research the spider silk protein coding gene architecture，protein modules and supply different kinds of gene resources for bio-mimicing spider silk,major ampullate spidroin gene-1(MaSp 1)gene is screened from anAraneusventricosus(A.ventricosus)Fosmid gene library by 3D/PCR (three-dimensional polymerase chain reaction)technology and partial MaSp1sequence is analyzed.By screening the Fosmid gene library,a positive clone containing the MaSp1gene is obtained,termed Av11-19-5,which is now being sequenced,and partial MaSp1coding gene,MaSp1RC,has already been found out.MaSp1RC is 786 bp in size and encodes 262 amino acids which can be divided into non-repetitive C terminal domain(CT) and repetitive domain(Rep).The Rep is mainly composed of poly-Ala,Glyxand GlyGlyxmodules,in which Ala and Gly content is about 78%.In CT domain,amino acids involved in forming salt bridge and hydrophobic domain in elix 4are highly conserved.The study result supplies a new biomimetic gene resource,and gives a basis for working with spider silk protein coding gene architecture and dimerization.

Araneusventricosus; major ampullate spidroin; 3D/PCR technology; sequence analysis

1671-0444(2015)01-0053-07

2013-11-04

國家“八六三”高技術研究發(fā)展計劃資助項目(2006AA03Z451)；國家自然科學基金資助項目(31070698)；上海市基礎研究重點資助項目(10JCl400300)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20120075110007)

張 雪(1988—)，女，上海人，碩士研究生，研究方向為蛛絲蛋白基因的篩選及分析．E-mail：zhangjessi@126.com

孟 清(聯(lián)系人)，男，教授，E-mail：mengqing@dhu.edu.cn

Q 78

A