摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對(duì)四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi Nikolsky）的眼球、心臟、腎臟、性腺、脾臟、肝臟、腦、鰓和肌肉9種組織中的乳酸脫氫酶同工酶、蘋果酸脫氫酶同工酶、谷氨酸脫氫酶同工酶、乙醇脫氫酶同工酶、酯酶同工酶5種同工酶進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，5種同工酶在四川裂腹魚9種組織均有表達(dá)，且具有明顯的組織特異性。

關(guān)鍵詞：四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi Nikolsky）；乳酸脫氫酶；蘋果酸脫氫酶；谷氨酸脫氫酶；乙醇脫氫酶；酯酶

中圖分類號(hào)：S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4540-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.037

同工酶是一類不同基因位點(diǎn)或等位基因表達(dá)的產(chǎn)物，同工酶變異比較豐富且能穩(wěn)定遺傳，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及魚類群體遺傳學(xué)研究中。同工酶技術(shù)試驗(yàn)方法規(guī)范、簡(jiǎn)便和快速，具有可以大量檢測(cè)分散于整個(gè)基因組中各基因座位等位基因間表型變異的特點(diǎn)，且不需要特殊的儀器設(shè)備，花費(fèi)相對(duì)低廉，數(shù)據(jù)處理的方法也已被認(rèn)可，是一種較好的種質(zhì)資源檢測(cè)方法[1]。魚類同工酶的研究已報(bào)道的主要有：姜建國(guó)等[2]對(duì)青魚（Mylopharyngodon piceus）不同組織中同工酶的表達(dá)模式的研究；張偉[3]對(duì)鄱陽(yáng)湖泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）細(xì)胞遺傳與繁殖生物學(xué)的研究；馬波等[4]對(duì)興凱湖翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）的肌、肝、眼、心4種組織的8種同工酶（LDH、EST、MDH、IDH、SOD、ME、G-6-PDH、ADH）的研究；唐文家[5]對(duì)黃河裸裂尻魚[Schizopygopsis pylzovi Kessler （Kess-ler）.]乳酸脫氫酶同工酶的研究；王金秋等[6]對(duì)松江鱸魚（Trachidermus fasciatus）不同組織同工酶的研究；全成干等[7]對(duì)大黃魚（Larimichthys crocea）養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的同工酶的研究；朱必鳳等[8]對(duì)鄱陽(yáng)湖鱖魚（Siniperca chuatsi）、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）肌肉4種同工酶的研究；吳瑯虎等[9]對(duì)高背銀鯽（Silver prussian carp）、大口胭脂魚（Ictiobus cyprinellus）及胭脂鯽（F1）不同組織的同工酶的表型的分析；吳興兵[10]對(duì)江蘇水域7種重要養(yǎng)殖魚類的同工酶和ISSR的分析；段彪等[11]對(duì)細(xì)鱗裂腹魚[Schizothorax chongi（Fang）]同工酶組織特異性的研究；胡思玉等[12]對(duì)昆明裂腹魚（Schizothorax grahami）同工酶組織特異性的研究；劉鴻艷等[13]魚類同工酶的應(yīng)用及研究進(jìn)展等。對(duì)四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi Nikolsky）同工酶的研究，僅見安苗等[14]對(duì)其4種組織5種同工酶的研究的報(bào)道。因此，本研究對(duì)四川裂腹魚9種組織中5種同工酶進(jìn)行了研究，并與其他魚類同工酶進(jìn)行了比較，評(píng)價(jià)其種質(zhì)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用四川裂腹魚標(biāo)本采自烏江上游總稽河，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周以上。試驗(yàn)時(shí)在冰盤中進(jìn)行常規(guī)測(cè)量，解剖取眼球、肌肉、心臟、性腺、肝臟、鰓、脾臟、腎臟和大腦9種組織。先用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）洗凈、吸去水分后取適量稱重，以樣品∶緩沖液=1∶3（W∶V）的比例混合，勻漿后于4 ℃下15 000 r/min 離心30 min，然后取上清液作電泳分析。

1.2 方法

采用聚丙烯酰胺作電泳支持物，電泳槽為DYCZ-24D型。電泳參考盧龍斗等[15]介紹的方法進(jìn)行，濃縮膠占5%，分離膠占10%，電極緩沖液為Tris-Gly溶液（pH 8.3）。進(jìn)樣量45～55 μL，指示劑為溴酚蘭，在4 ℃下進(jìn)行電泳，染色方法參照盧龍斗等[15]、何忠效等[16]和吳興兵[10]的方法并略加改進(jìn)，染色完畢后用TANON GIS1000凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照及結(jié)果分析，同工酶的命名以向陽(yáng)極方向泳動(dòng)最快的編為1號(hào)，以下各酶分別編為2、3、4等號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶（EST）

魚類酯酶的多態(tài)現(xiàn)象非常普遍，酶譜表現(xiàn)復(fù)雜。四川裂腹魚EST同工酶的酶譜表現(xiàn)較為復(fù)雜，在9種組織中均有表現(xiàn)，各組織中的酶活性均較強(qiáng)，只有肌肉稍弱。9種組織共檢測(cè)到7條酶帶（圖1），其中EST1僅在腦中檢出，EST2、EST3僅在肝臟中檢出，分布較廣的是EST5、EST6、EST7，在9種組織中均檢出。

同工酶酶譜可明顯分為3個(gè)區(qū)域（圖1），推測(cè)至少由3個(gè)基因位點(diǎn)編碼，各組織間特異性小，9 種組織均具有EST5、EST6、EST7。EST1僅見于腦，且活性非常弱；EST2、EST3僅見于肝臟，可能與肝臟的解毒作用有關(guān)；EST4存在除了性腺和脾臟外的其他7種組織。從EST5、EST6、EST7的活性強(qiáng)度看，EST5在鰓中表現(xiàn)活性最強(qiáng)，EST6、EST7在肝臟中表現(xiàn)活性最強(qiáng)。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）

乳酸脫氫酶（LDH）是參與糖酵解的關(guān)鍵酶，現(xiàn)已知大多數(shù)脊椎動(dòng)物的LDH同工酶由A、B、C 3個(gè)位點(diǎn)決定，通常C位點(diǎn)具有組織的差異，其編碼的蛋白質(zhì)電荷與A、B不同。本試驗(yàn)中共檢測(cè)出約17條酶帶（圖2），并具有明顯的組織特異性，表明四川裂腹魚LDH同工酶至少由A、B、C 3個(gè)位點(diǎn)控制。LDH5、LDH9、LDH11、LDH14、LDH17等酶僅在肝臟中檢出，LHD8僅在眼球中檢出，LHD15僅在腦中檢出，LDH2僅在眼球和肌肉中檢出，LDH13僅在性腺和鰓中檢出。肝臟中檢出的6種酶，除LDH1在心臟、腎臟、脾臟檢出外，剩下的均未出現(xiàn)在其他組織中?；钚宰顝?qiáng)為心臟中LDH10，最弱的是LDH1在肝臟中的表現(xiàn)。

2.3 蘋果酸脫氫酶（MDH）

蘋果酸脫氫酶（MDH）存在有相互不形成異聚體的線粒體型（m-MDH）和上清液型（s-MDH）兩部分，均是兩個(gè)基因編碼的二聚體。四川裂腹魚蘋果酸脫氫酶也有線粒體型（m-MDH）和上清液型（s-MDH）兩種類型（圖3），且具有明顯的組織特異性。線粒體型（m-MDH）的MDH7、MDH8、MDH9僅在脾臟、腦和肌肉中檢出，其中MDH8、MDH9僅在肌肉中檢出，MDH3僅在腦組織中檢出，MDH6僅在肝臟中檢出，MDH1、MDH8、MDH9僅在肌肉中檢出。9種組織共檢測(cè)到9條酶帶，多于理論上二聚體兩基因編碼最多形成3條酶帶，可能與m-MDH也存在基因編碼后的化學(xué)修飾有關(guān)，也有可能與四川裂腹魚的染色體多倍性相關(guān)。

2.4 谷氨酸脫氫酶（GDH）

谷氨酸脫氫酶為兩個(gè)位點(diǎn)編碼的二聚體，四川裂腹魚9種組織共檢測(cè)出13條酶帶（圖4），具有明顯的組織特異性。其中GDH1僅在肝臟中檢出，GDH10僅在鰓組織中檢出，GDH4僅存在性腺和脾臟組織中，GDH6僅存在于腦和肌肉組織中。谷氨酸脫氫酶在心臟和眼球組織中表達(dá)較為充分，活性較強(qiáng)，在肝臟、脾臟和性腺等組織中較弱。

2.5 乙醇脫氫酶（ADH）

乙醇脫氫酶為兩個(gè)位點(diǎn)編碼的二聚體，四川裂腹魚9種組織共檢測(cè)到12條酶帶，酶譜特征較為一致，活性較強(qiáng)，但表現(xiàn)出明顯的組織特異性（圖5）。肝臟中有特異帶ADH1，脾中有特異帶ADH6，腦中有特異帶ADH10。肝臟中ADH1的活性強(qiáng)于其他組織中的活性，可能與肝臟的解毒作用有關(guān)。ADH2僅在心臟和腎臟檢出，ADH5僅在眼球和脾臟中檢出。ADH12分布較為廣泛，分布在除眼球外的所有組織中，其次是ADH11和ADH4。酶活性最強(qiáng)的組織是眼球和心臟，最弱的是脾臟。

3 小結(jié)與討論

朱藍(lán)菲等[17]對(duì)20種鯉科魚類的LDH同工酶進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)LDH在鯉科魚類進(jìn)化中已分成兩種主要支系，一支起源于雅羅魚亞科，表現(xiàn)出A基因的保守性，其特點(diǎn)為L(zhǎng)DH-B4同工酶的遷移率不斷變慢，直到與LDH-Aa同工酶接近；另一支起源于鲴亞科，表現(xiàn)出B基因的保守性，其特點(diǎn)是LDH同工酶的遷移率不斷加快，直到與LDH-B4同工酶接近。唐文家[5]對(duì)黃河裸裂尻魚的酶譜經(jīng)過比較研究，LDH-A基因和LDH-B基因保守性較差，兩種基因在黃河裸裂尻魚都有表達(dá)。

裂腹魚亞科魚類是原始鲃?lì)愰L(zhǎng)期適應(yīng)高原特殊環(huán)境而產(chǎn)生的一個(gè)自然類群，陳毅峰[18]曾推測(cè)該亞科魚類應(yīng)當(dāng)是四倍體起源的魚類，在其演化中涉及了多倍體甚至多次多倍體過程。本研究中四川裂腹魚5種同工酶的基因位點(diǎn)、酶活性及同工酶類型都存在不同程度的組織特異性，與同為四倍體類型的黃河裸裂尻魚相似。其中，EST的位點(diǎn)和酶帶數(shù)目在歷次研究中起伏較大，除與試驗(yàn)材料（魚的年齡、發(fā)育階段、生活環(huán)境、生理狀態(tài)、樣本采集與保存等）和試驗(yàn)方法（電泳支持物、緩沖系統(tǒng)、電泳條件等）有關(guān)外，推測(cè)可能還與EST本身比較復(fù)雜且弱帶顯帶不穩(wěn)定有關(guān)。9種組織都有LDH同工酶，但活性有差異，且C基因只位于肝臟中，因而LDH4、LDH7、LDH9、LDH11、LDH13只在肝臟中表現(xiàn)。此外，在眼球和肌肉中還可能存在一些特殊的基因，LDH2僅在這兩種組織中得到表現(xiàn)。MDH在9種組織的分子類型完全不同，酶活性也不完全相同，除腦以外其他組織中都有m-MDH，且活性比較強(qiáng)。GDH和ADH僅在肝臟和肌肉中檢測(cè)到活性，而本研究中在幾種組織中均檢測(cè)到其活性，與胡思玉等[12]的研究結(jié)果一致，表明它們同屬魚體組織普遍表達(dá)的酶帶，這些酶可用于遺傳資源的評(píng)估。

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