鄧曉輝等

摘要：利用16對(duì)SSR引物對(duì)17份非洲結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata L）種質(zhì)資源材料和8個(gè)中國(guó)結(jié)球甘藍(lán)品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究。結(jié)果顯示，有10對(duì)SSR引物在25個(gè)資源材料間表現(xiàn)為多態(tài)性。共檢測(cè)到32個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對(duì)引物的等位基因位點(diǎn)變幅為1～4，平均為3.2，等位基因數(shù)為25，平均為2.5。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，在相似系數(shù)為0.534的水平上可將25份結(jié)球甘藍(lán)資源材料聚為4大類群。揭示了引進(jìn)非洲結(jié)球甘藍(lán)資源的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞：結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata L）；SSR；遺傳多樣性；聚類分析；非洲

中圖分類號(hào)：S635；Q943.2；Q16.04 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4498-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.027

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata L）起源于地中海一帶，是世界上種植最廣泛的蔬菜之一，現(xiàn)在中國(guó)甘藍(lán)（B. oleracea L.）種植面積有70萬hm2，在蔬菜生產(chǎn)上具有重要的地位[1]。在作物育種領(lǐng)域，種質(zhì)資源越豐富，越易選育出理想的優(yōu)良新品種，因此，種質(zhì)資源的遺傳多樣性對(duì)于甘藍(lán)新品種選育意義重大。從系譜關(guān)系和表型性狀來研究種質(zhì)資源的遺傳多樣性雖然有效，但受到環(huán)境和人為因素的影響較大，對(duì)于引進(jìn)的國(guó)外種質(zhì)資源，其系譜關(guān)系往往難以查找。DNA分子標(biāo)記技術(shù)為從分子層面上揭示種質(zhì)資源的遺傳差異開辟了新的途徑。目前國(guó)內(nèi)外研究者應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)甘藍(lán)類資源材料已開展了一些研究，如2011年Saxena等[1]用RAPD和SSR標(biāo)記分析了甘藍(lán)栽培種的遺傳多樣性，2013年Izzah等[2]用SSR分子標(biāo)記研究了分屬于6個(gè)類型的91個(gè)甘藍(lán)品種的遺傳多樣性，2015年P(guān)ang等[3]用SSR和SNP標(biāo)記分析了葉用甘藍(lán)（B. rapa L）的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)。SSR標(biāo)記具有共顯性、高多態(tài)性、高穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在各項(xiàng)研究中得到了廣泛應(yīng)用。近2年湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從非洲引進(jìn)了17份結(jié)球甘藍(lán)資源材料，用8份國(guó)內(nèi)推廣應(yīng)用的商品甘藍(lán)為對(duì)照，采用SSR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析，以期更好地了解這批資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，從而為有效利用這批資源打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院近2年從南非、莫桑比克和津巴布韋等非洲國(guó)家引進(jìn)的17份結(jié)球甘藍(lán)資源材料和8份國(guó)內(nèi)甘藍(lán)大田生產(chǎn)上推廣的商品品種，共25份材料其編號(hào)、名稱、結(jié)球類型、熟性、來源等信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品總DNA提取 每個(gè)參試材料取8個(gè)單株的幼嫩葉片，混合后作為提取材料?？侱NA提取采用Saghai-Maroof等[4]的CTAB法，并略有改動(dòng)。提取的DNA樣品用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度及純度，然后稀釋成10 ng/μL備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 用30對(duì)SSR引物對(duì)參試甘藍(lán)材料進(jìn)行分析，SSR引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，PCR反應(yīng)參照Saal等[5]的方法，在 Eppendorf Mastercycler PCR儀上進(jìn)行。采用10 μL PCR體系：DNA（10 ng/μL）1.0 μL，H2O 4.7 μL，10×Buffer 1.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.2 μL，Taq（5 U/μL）0.1μL，25 mmol/L Mg2+1 μL和引物F/R 1 μL×2。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，緩沖液為5×TBE，電壓120 V，電泳45 min左右。銀染檢測(cè)：10%乙醇100.0 mL+0.5 mL冰乙酸固定4 min，0.2% AgNO3染色10 min，蒸餾水洗2～3次，3% NaOH溶液400 mL+7 mL甲醛顯影，蒸餾水洗滌2次，照相，保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析各樣本DNA的擴(kuò)增條帶，在相同的遷移距離上，強(qiáng)帶記為1，弱帶重復(fù)出現(xiàn)也記為1，弱帶出現(xiàn)但不重復(fù)記為0，無帶記為0。樣本x與樣本y之間的遺傳距離參照Nei等[6]的公式計(jì)算，GDxy=1-2Nxy/（Nx+Ny），Nxy表示樣本x與樣本y所共有的條帶，Nx代表樣本x的所有條帶，Ny代表樣本y的所有條帶。將計(jì)算得到的遺傳相似系數(shù)用軟件NTSYS-PC2.1的非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構(gòu)建聚類圖。SSR位點(diǎn)的多態(tài)性按公式PIC=1-∑Pi2計(jì)算，有效等位基因數(shù)為E=1/∑Pi2，Pi為第i位點(diǎn)的基因頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性

在供試的非洲結(jié)球甘藍(lán)資源材料中隨機(jī)選擇5個(gè)不同來源的材料進(jìn)行SSR引物篩選，選取其中擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的引物用于供試材料的遺傳多樣性分析。從30對(duì)引物中選出16對(duì)多態(tài)性高的SSR引物用于進(jìn)一步的試驗(yàn)，這16對(duì)SSR引物在25個(gè)材料間能擴(kuò)增出產(chǎn)物的有10對(duì)，占所用引物的62.5%。在10對(duì)引物上共檢測(cè)到32個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對(duì)SSR引物的等位基因位點(diǎn)數(shù)變幅為1～4個(gè)，平均為3.2個(gè)。其中，24號(hào)引物的等位基因位點(diǎn)數(shù)最多，為4個(gè)；大部分引物的等位基因位點(diǎn)數(shù)在2～3個(gè)范圍內(nèi)。

2.2 甘藍(lán)材料遺傳相似性分析

根據(jù)10對(duì)SSR引物在25份供試材料中所獲得的32個(gè)等位基因位點(diǎn)，按Nei的方法利用NTSYSPC2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算供試品種間的遺傳相似系數(shù)（GS），結(jié)果遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.24～0.87 之間。其中12號(hào)和26號(hào)的遺傳相似性最大（GS=0.87），說明兩者有非常近的遺傳關(guān)系；而65號(hào)與34號(hào)、37號(hào)之間的遺傳相似性最小（GS=0.24），說明它們之間的遺傳距離比較遠(yuǎn)。

2.3 聚類分析

以獲得的SSR標(biāo)記遺傳相似系數(shù)矩陣為原始數(shù)據(jù)，在NTSYS-2.0軟件上用UPGMA法對(duì)參試所有結(jié)球甘藍(lán)資源材料進(jìn)行聚類分析，并繪制樹狀圖，具體見圖1。從圖1可見，以遺傳相似系數(shù)0.534為閾值，可將參試的25份材料分為4個(gè)大類群。第Ⅰ類群為1個(gè)材料，標(biāo)號(hào)為65號(hào)，是來源于毛里求斯的中熟扁圓結(jié)球甘藍(lán)；第Ⅱ類為34號(hào)和37號(hào)，都是來自中國(guó)的中熟扁圓結(jié)球甘藍(lán)商品品種；第Ⅲ類為95號(hào)，為來自坦桑尼亞的中熟扁圓結(jié)球甘藍(lán)；第Ⅳ類為余下的其他結(jié)球甘藍(lán)材料；其中在相似系數(shù)0.662處，7號(hào)、32號(hào)、12號(hào)、26號(hào)、96號(hào)可聚為一類，球形都為牛尖形，都來自非洲，12號(hào)和26號(hào)球形一致又都是早熟類型，因此在聚類分析上表現(xiàn)為十分相似。從圖1還可看出，在相似系數(shù)0.706處，圓頭中熟的1號(hào)、6號(hào)、17號(hào)和47號(hào)聚在一起，這4個(gè)材料都來自非洲；說明相同來源的材料親緣關(guān)系較近，相同生態(tài)類型的材料親緣關(guān)系也較近。上述聚類結(jié)果說明，利用32個(gè)SSR標(biāo)記可以確定本試驗(yàn)中25份不同類型結(jié)球甘藍(lán)材料間的遺傳差異。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，SSR標(biāo)記可用于對(duì)引進(jìn)的非洲結(jié)球甘藍(lán)種質(zhì)資源進(jìn)行有效的遺傳多態(tài)性檢測(cè)。以遺傳相似系數(shù)為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA分析，在相似系數(shù)為0.534的水平時(shí)可將25個(gè)甘藍(lán)種質(zhì)材料聚為4個(gè)大類，聚類分析結(jié)果與非洲結(jié)球甘藍(lán)資源的地理來源、熟性和球形有一定的相關(guān)性，這與宋立曉等[7]、繆體云等[8]、苗明軍[9]和李寧等[10]的研究結(jié)果一致。并且同一地域的多數(shù)材料可以聚在一起，如第Ⅱ類群的2個(gè)材料均來源于中國(guó)，但同時(shí)也存在不同地理來源的材料聚在一起的現(xiàn)象，也許是因?yàn)椴煌貐^(qū)間資源的交流致使某些基因在不同地區(qū)種質(zhì)間的相互滲透所致。同一球形和熟性的材料大多聚在一起，如牛尖形的材料形成一個(gè)聚類，但其中來自東非和南非的2個(gè)羽衣甘藍(lán)也聚在了該類，而且獨(dú)立成為了一個(gè)小類，可能是采用的標(biāo)記較少，沒能將其從牛尖形中分離出去造成的。

試驗(yàn)對(duì)非洲引進(jìn)的17份甘藍(lán)資源和國(guó)內(nèi)的8份甘藍(lán)商品品種進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)引進(jìn)的非洲資源與國(guó)內(nèi)的甘藍(lán)品種遺傳上存在差異，說明引進(jìn)的非洲甘藍(lán)種質(zhì)資源具有不同的基因背景，能豐富中國(guó)的甘藍(lán)種質(zhì)資源，增加其遺傳多樣性，這將使今后育成品種的適應(yīng)性更廣、性狀更加優(yōu)異。

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