高同國等

摘要：從實(shí)驗(yàn)室保存的237株細(xì)菌中篩選得到一株對大豆根腐病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）具有較強(qiáng)拮抗能力的菌株8-32，該菌株經(jīng)生理生化試驗(yàn)、16S rRNA基因序列分析最終鑒定為Bacillus subtilis。以尖孢鐮刀菌為病原菌研究了菌株8-32在盆栽條件下對大豆根腐病的防治作用。結(jié)果表明，菌株8-32可以有效防治大豆根腐病的發(fā)生，其防治效果最高可達(dá)32.08%，并且8-32可以明顯促進(jìn)大豆植株幼苗的生長，使株高增加7.7%～15.8%；使葉綠素含量提高7.8%～12.9%；大豆POD活性增加11.6%～63.8%；說明菌株8-32對由尖孢鐮刀菌引起的根腐病具有顯著的防治效果，具有進(jìn)一步應(yīng)用的潛力。

關(guān)鍵詞： 大豆根腐??； 生物防治； Bacillus subtilis； 生防效果

中圖分類號：Q949.32；R151 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4489-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.025

大豆是重要的經(jīng)濟(jì)及油料作物，原產(chǎn)于中國，而2000年中國成為全球最大的大豆進(jìn)口國，2013年進(jìn)口量為6338萬t，占全球大豆貿(mào)易總量的60%，對進(jìn)口大豆的依存度高達(dá)80%左右。中國大豆種植產(chǎn)業(yè)面臨來自國際市場的巨大壓力，中國大豆單位面積產(chǎn)量遠(yuǎn)低于其他主要大豆生產(chǎn)國（美國、阿根廷、巴西等），而由大豆根腐病引起的連作障礙是引起大豆減產(chǎn)的重要原因之一[1]。大豆根腐病是一種分布廣、危害重、病原菌種類繁多和防治困難的世界性病害，其中尤其以美國、日本、加拿大和中國等地發(fā)病嚴(yán)重[2]。在中國該病主要集中在東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)，僅黑龍江省每年發(fā)病面積就達(dá)7×105 hm2左右，占大豆播種面積的1/3以上。根腐病造成的產(chǎn)量損失一般達(dá)10%～30%，嚴(yán)重的可達(dá)50%～60%，甚至絕產(chǎn)[3]，因此大豆根腐病每年給國家造成數(shù)億元的經(jīng)濟(jì)損失。

中國自80年代以來相繼開展了大豆根腐病的防治研究，直到現(xiàn)在還主要依靠化學(xué)藥劑防治?；瘜W(xué)藥劑的大量使用不僅導(dǎo)致土壤水體污染，威脅食品安全，直接危害人類健康，并且還會引起根腐病病原菌出現(xiàn)抗性，甚至抑制大豆的結(jié)瘤和氮的固定[4]。生物防治技術(shù)避免了化學(xué)農(nóng)藥帶來的一系列問題而成為植物病害防治的重要手段。目前用于生物防治的菌株涉及到放線菌、細(xì)菌和真菌，其中研究最多的是芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），芽孢桿菌可以產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，抗逆能力強(qiáng)，繁殖速度快，營養(yǎng)要求簡單，易定殖在植物表面，芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢對于生防制劑生產(chǎn)和儲存都是十分有利的[5]，芽孢桿菌正逐漸成為世界上生防細(xì)菌研究的重點(diǎn)。

在前期工作中，以大豆根腐病病原菌即尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為指示菌，采用平板對峙法從實(shí)驗(yàn)室保存的237株芽孢桿菌中篩選得到一株具有較強(qiáng)拮抗能力的菌株8-32，對菌落菌體形態(tài)、生理生化性質(zhì)及16S rRNA基因序列進(jìn)行分析、鑒定。本試驗(yàn)采用盆栽方法對其生防效果進(jìn)行了驗(yàn)證，以期為開發(fā)大豆根腐病生防菌劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

指示菌為尖孢鐮刀菌，由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究院王光華教授提供。細(xì)菌為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分離保存的237株細(xì)菌。大豆為冀豆12，購買于種子市場。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖或蔗糖20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，瓊脂15～18 g；NB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2；每1 000 mL NB培養(yǎng)基中加入瓊脂15～18 g為NA培養(yǎng)基。

1.3 微生物活化

尖孢鐮刀菌的活化采用PDA培養(yǎng)基，用打孔器取直徑6 mm的指示菌（尖孢鐮刀菌）菌餅，置于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，待用。細(xì)菌的活化采用NA培養(yǎng)基，將4 ℃保存的細(xì)菌接種在NA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)24 h后取出一環(huán)接種于NB培養(yǎng)基中，置于搖床中以37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)48 h待用。

1.4 盆栽試驗(yàn)

采集農(nóng)田土，風(fēng)干后過10目篩，每盆（直徑13 cm×高12 cm）裝土1 000 g。澆透水晾2 d后，每盆放5塊直徑為6 mm的尖孢鐮刀菌菌餅。將表面消毒后的大豆播種于盆中，每盆保苗3株，每個(gè)處理60盆。同時(shí)，在每粒種子上加入1 mL濃度為1×106 CFU/mL（處理1）或1×108 CFU/mL（處理2）的Bacillus subtilis 8-32菌液。待大豆生長到第7天、第14天和第21天對大豆根腐病病情指數(shù)進(jìn)行調(diào)查，并測定其株高、植株干重、葉片中葉綠素含量和根部過氧化酶系（CAT、POD）活性的變化。

1.5 病情指數(shù)

每個(gè)處理取20盆，對盆中60株大豆幼苗發(fā)病程度進(jìn)行分析，根據(jù)根腐病分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）對大豆幼苗根部進(jìn)行分級。

分級后對病情指數(shù)進(jìn)行計(jì)算：

病情指數(shù)=100×∑（級數(shù)×該級株數(shù)）/（發(fā)病最高級數(shù)×總株數(shù)）

1.6 葉綠素含量測定

葉綠素的測定參照文獻(xiàn)[6]。選取生長發(fā)育正常、無病蟲害、無干葉的大豆葉片，暗處保存。在避光室內(nèi)，取出待測樣品，剪碎，混勻。精確稱取2.0 g樣品于研缽中，加少量碳酸鈣及80%丙酮溶液3 mL研磨勻漿，再加丙酮10 mL繼續(xù)研磨至葉片組織變白。將研磨后的樣品濾入100 mL棕色容量瓶中，并用80%丙酮定容至100 mL，測定葉綠素含量。

80%丙酮作參比液，分別在645 nm和665 nm處測定樣品液的吸光值，并且按下列公式計(jì)算葉綠素含量，重復(fù)3次。

葉綠素含量=（20.29A645 nm+8.04A665 nm）×V/1000×W

其中A645 nm、A665 nm分別為645 nm和665 nm時(shí)的吸光度，V為提取液總體積（mL），W為葉片鮮重（g）。

1.7 POD活性測定

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[7]，以1 min內(nèi)OD470 nm變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位（U）。取大豆病根1 g放入研缽中，加5 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿后以4 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶提取液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 mL試管4支，3支測定，1支對照。每支試管加2.9 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液，1 mL 0.05 moL/L愈創(chuàng)木酚和0.1 mL粗酶液，對照組用1 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液代替粗酶液。反應(yīng)體系加入粗酶液后，立即于37 ℃水浴中保溫15 min，加入1 mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的H2O2后立即測定，470 nm波長下測定吸光度。

根據(jù)公式計(jì)算出酶活性，計(jì)算公式為：POD活性[U/（g Fw·min）]=（Vt×ΔOD）/0.01Fw×V2×Δt

式中，每分鐘內(nèi)變化0.01為1個(gè)活性單位（U），過氧化物酶活性單位[U/（g Fw·min）]；其中ΔOD為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，比色波長為470 nm；Δt為ΔOD對應(yīng)的時(shí)間（min）；Vt為酶液總體積（mL）；V2為測定時(shí)取用的提取酶液體積（mL）；Fw為樣品鮮重（g）。

1.8 CAT活性測定

CAT活性測定采用紫外吸收法[8]， 以1 min內(nèi)ΔA240 nm減少0.1的酶量為1個(gè)過氧化氫酶活性單位（U）。稱取大豆根部樣品0.5 g放置于遇冷研缽中，加2～3 mL pH 7.0的磷酸緩沖液（4 ℃預(yù)冷），冰浴研磨勻漿移至25 mL容量瓶中。用磷酸緩沖液沖洗研缽數(shù)次，定容。將容量瓶置于5 ℃冰箱中靜置10 min。取上清液于離心管中離心（4 ℃，4 000 r/min，15 min），上清液即為粗酶提取液，取上清液并在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 mL試管4支，3支測定，1支對照。每支試管加2 mL去離子水，3 mL pH 7.8的磷酸緩沖液，0.4 mL粗酶液，對照加等量的磷酸緩沖液。試管于25 ℃水浴中預(yù)熱3 min后，各加0.1 moL/L的過氧化氫溶液0.6 mL，每加1管立即測A240 nm，分別于60、120、180 s記錄每支試管的測量值。

CK組測得的吸光值記為A0，處理1記為A1，處理2記為A2。

ΔA240 nm=A0-（A1+A2）/2

過氧化氫酶活性[U/（g FW·min）]=ΔA240×Vt/（0.1V1×t×Fw）

Vt為酶液總體積（mL）；V1為測定時(shí)取用的提取酶液體積（mL）；Fw為樣品鮮重（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌8-32對大豆的促生作用

研究了生防菌8-32對大豆幼苗的促生作用，結(jié)果見表2。表明8-32有效促進(jìn)了大豆的生長，當(dāng)每粒種子加入1×106 CFU/mL菌液后，其第1周、第2周、第3周株高分別增加12.5%、9.3%和7.7%，而當(dāng)加入量為1×108 CFU/mL時(shí)，第1周至第3周株高分別增加15.8%、11.6%和13.1%，并且干物質(zhì)重量都有明顯的增加。進(jìn)一步采用Sackowskis比色法測定，以LB為培養(yǎng)基，30 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后，測得發(fā)酵上清液中吲哚乙酸（IAA）的質(zhì)量濃度為45.29 mg/L。

在植物病害生物防治領(lǐng)域中，枯草芽孢桿菌已經(jīng)成為主要的生防細(xì)菌之一，它具有較強(qiáng)的防病作用。IAA是一種重要的植物激素，可以促進(jìn)植物根系生長發(fā)育[9]，研究表明，8-32具有較強(qiáng)的IAA產(chǎn)生能力，具有促進(jìn)大豆生長的能力。

2.2 枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病的防治效果

通過大豆盆栽試驗(yàn)研究了枯草芽孢桿菌對大豆根腐病的防治效果，結(jié)果見表3、表4。表明8-32對大豆幼苗根腐病具有明顯的防治作用，其生防效果為13.22%～32.08%，并且處理1生防效果優(yōu)于處理2，處理1在大豆栽培第2周時(shí)防治效果達(dá)到最高，為32.08%。試驗(yàn)中分別采用2種濃度的8-32進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，其中處理1（1×108 CFU/mL）菌含量明顯低于處理2（1×108 CFU/mL），但防治效果卻較處理2更明顯，其原因還需進(jìn)一步分析。

2.3 枯草芽孢桿菌8-32對大豆葉綠素含量的影響

葉綠素含量的多少是檢測植物光合作用強(qiáng)弱和有機(jī)物合成能力的重要指標(biāo)，并且與氮素營養(yǎng)有密切關(guān)系。試驗(yàn)中進(jìn)一步研究了枯草芽孢桿菌8-32對大豆植株中葉綠素含量的影響，結(jié)果見圖1。與對照組相比，8-32增加了葉片中葉綠素的含量。在第1周，處理1和處理2分別較CK高9.2%和12.4%，在第2周時(shí)處理1、處理2較CK分別增加了12.3%和12.9%，第3周處理1和處理2較CK高7.8%和8.8%?？莶菅挎邨U菌8-32可以提高大豆幼苗葉片中葉綠素的含量。

2.4 枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病根系過氧化物酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)可以減小活性氧對細(xì)胞產(chǎn)生的危害，與植物抗逆具有密切聯(lián)系[10，11]。本試驗(yàn)研究了大豆幼苗POD及CAT酶的活性變化。其中POD活性見圖2，結(jié)果表明，8-32有效增加了大豆幼苗根部POD的活性，處理2優(yōu)于處理1。第1周時(shí)處理1和處理2分別比對照組提高了19.7%和32.8%，第2周時(shí)處理1和處理2的POD活性分別比對照增加11.6%和41.8%，第3周分別增加22.4%和63.8%，上述結(jié)果與溫廣月[12]研究18BR2-2對大豆根腐病的生防效果一致。

2.5 枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病根系過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶同樣是抗氧化酶系的主要組成之一。由圖3可以看出，接種8-32后第1周及第2周CAT活性有明顯的提高，在第3周不明顯。其中以第2周處理1提高幅度最大，達(dá)50%，說明8-32可以提高大豆根部過氧化氫酶的活性。

3 小結(jié)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病具有一定的防治效果，當(dāng)接種濃度為1×106 CFU/（mL·株）時(shí)，可以有效防治大豆根腐病的發(fā)生，其防治效果達(dá)到32.08%。并且使用8-32可以有效提高大豆葉片中葉綠素含量，增加植株根系過氧化物酶及過氧化氫酶等抗氧化酶系的活力。8-32具有較強(qiáng)的大豆根腐病的防治能力，可進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，但其機(jī)理尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

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