冼健安 , 錢 坤, 郭 慧, 王冬梅 張秀霞 苗玉濤, 潘訓(xùn)彬, 王安利

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所, 海南 ?？?571101; 2. 華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510631; 3. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524025)

雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國南方重要的名貴海水水產(chǎn)品。近年來, 由于鮑類疾病的肆虐,鮑類養(yǎng)殖業(yè)遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失, 迫切需要對(duì)鮑類的免疫及病理學(xué)進(jìn)行深入研究。鮑類只有先天性異性免疫功能, 血細(xì)胞在其細(xì)胞免疫和體液免疫過程中均起著十分重要的作用, 如對(duì)病原體進(jìn)行吞噬和包裹, 釋放各類抗菌因子等[1]。目前鮑類血細(xì)胞的研究仍相對(duì)滯后, 主要還集中在血細(xì)胞的分類和結(jié)構(gòu)研究上[2-5], 對(duì)各類血細(xì)胞的具體功能和相互協(xié)同作用仍知之甚少。研究滯后的其中一個(gè)主要原因是受限于研究技術(shù), 對(duì)血細(xì)胞在細(xì)胞水平上的研究一直依賴于各類顯微鏡。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)是早在 20世紀(jì) 70年代發(fā)展起來的,對(duì)細(xì)胞的物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù), 具有客觀準(zhǔn)確、快速、同時(shí)測(cè)定多個(gè)指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn), 在臨床上的應(yīng)用已十分廣泛, 近年來已逐步應(yīng)用到水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物如蝦類[6-8]和雙殼類[9-12]的研究中, 但在鮑類血細(xì)胞上的研究仍甚少[13-14]。本研究應(yīng)用FCM 分析雜色鮑血細(xì)胞的分類、結(jié)構(gòu)和免疫功能,為進(jìn)一步研究鮑類血細(xì)胞免疫以及病害防治研究提供基礎(chǔ)資料, 并建立一套快捷、準(zhǔn)確的鮑類血細(xì)胞指標(biāo)的FCM檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

雜色鮑(Haliotis diversicolorReeve)購自廣州黃沙水產(chǎn)品市場(chǎng), 規(guī)格為殼長 6～7cm, 于實(shí)驗(yàn)室海水(鹽度 30, 溫度 20～22℃)中充氣暫養(yǎng) 1周, 暫養(yǎng)期間定時(shí)投喂海帶, 清理殘餌和糞便。

二乙酸熒光素(FDA)和 2’, 7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)購自 Sigma公司, Annexin VFITC/PI(碘化丙啶)凋亡檢測(cè)試劑盒、LysoTracker Red、MitoTracker Green和黃綠色熒光微球(yellow-green fluorescent carboxylate-modified FluoSpheres?beads, 直徑1 μm)購自Invitrogen公司, 其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 血細(xì)胞懸液的制備

采用腹足創(chuàng)傷法取鮑血淋巴, 用過濾無菌海水以1∶1稀釋, 此時(shí)細(xì)胞密度約為106個(gè)/mL。共測(cè)定10只鮑, 每個(gè)個(gè)體的稀釋血淋巴作為一單獨(dú)樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.3 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀為美國 BD(Becton Dickinson)公司FACSCalibur, 應(yīng)用 CellQuest軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取和分析。前向角散射光(Forward light scatter,FSC)反映細(xì)胞大小, 側(cè)向角散射光(Side light scatter,SSC)反映細(xì)胞顆粒復(fù)雜度; FITC(異硫氰酸熒光素)、MitoTracker Green、黃綠色熒光微球、FDA和DCF(2’, 7’-二氯熒光黃)的綠色熒光用第一熒光通道(FL1)檢測(cè), PI和LysoTracker Red的紅色熒光用第二熒光通道(FL2)檢測(cè)。

1.4 血細(xì)胞分類與組成比例

稀釋血淋巴用 200目篩網(wǎng)過濾后直接上機(jī)進(jìn)行檢測(cè), 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。以SSC為橫坐標(biāo)、FSC為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖, 在SSC-FSC散點(diǎn)圖上設(shè)門劃分各個(gè)細(xì)胞亞群, 分析各類血細(xì)胞所占的比例。

1.5 血細(xì)胞凋亡率

以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血細(xì)胞的自然凋亡率。血淋巴取出后, 立即進(jìn)行離心然后重懸于1x Annexin V結(jié)合緩沖液中, 調(diào)整細(xì)胞濃度約 3×106個(gè)/mL, 每 100 μL血細(xì)胞懸液加入 5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液, 避光染色15 min,再加入400 μL 1x Annexin V結(jié)合緩沖液, 200目篩網(wǎng)過濾后立即上機(jī)檢測(cè), 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度(FL1)為橫坐標(biāo), PI熒光強(qiáng)度(FL2)為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)圖顯示。如圖 2, 用十字門劃分各類細(xì)胞的區(qū)域: 活細(xì)胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于象限 a, 前期凋亡細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于象限b, 后期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于象限c, 分析各象限細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。細(xì)胞總凋亡和死亡率為前期凋亡、后期凋亡和死亡細(xì)胞(象限b+c)所占的比例。為避免血細(xì)胞離體時(shí)間過長對(duì)結(jié)果造成影響,從樣品制備到上樣的整個(gè)過程應(yīng)盡量控制在30 min以內(nèi)。

1.6 吞噬活性

以黃綠色熒光微球作為被吞噬物測(cè)定血細(xì)胞的吞噬活性。分別取血細(xì)胞懸液 400 μL, 加入 10 μL濃度為 1/10的微球稀釋液, 室溫避光孵育 1 h, 用200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè), 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以FL1熒光量為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示, 以標(biāo)尺劃定吞噬微球的區(qū)域, 分析吞噬不同數(shù)量微球的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。

1.7 線粒體數(shù)量

應(yīng)用MitoTracker Green作為線粒體的特異性熒光探針, MitoTracker Green對(duì)于線粒體的染色不依賴于線粒體膜電位。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入50 nmol/L MitoTracker Green室溫避光孵育30 min, 用200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè), 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以MitoTracker Green熒光量(FL1)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù) SSCFSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群, 作不同類型血細(xì)胞的MitoTracker Green直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的 MitoTracker Green平均熒光量, 細(xì)胞的 Mito-Tracker Green熒光量與線粒體數(shù)量成正比。

1.8 溶酶體數(shù)量

應(yīng)用LysoTracker Red作為溶酶體的特異性熒光探針, 它是DND99進(jìn)行了熒光標(biāo)記的帶有弱堿性的熒光探針, 可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于溶酶體的特異性熒光標(biāo)記。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入50 nmol/L LysoTracker Red室溫避光孵育60 min, 用200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè), 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以LysoTracker Red熒光量(FL2)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù)SSC-FSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群,作不同類型血細(xì)胞的 LysoTracker Red直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的 LysoTracker Red平均熒光量, 細(xì)胞的LysoTracker Red熒光量與溶酶體數(shù)量成正比。

1.9 非特異性酯酶活性

以FDA為標(biāo)記探針檢測(cè)非特異性酯酶活性的變化。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入5 μmol/LFDA室溫避光孵育30 min, 經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè), 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以FDA熒光量(FL1)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù)SSC-FSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群,作不同類型血細(xì)胞的FDA直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的FDA平均熒光量, 細(xì)胞的FDA熒光量與非特異酯酶活性成正比。

1.10 活性氧(ROS)含量

以DCFH-DA為標(biāo)記探針檢測(cè)ROS含量的變化。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入10 μmol/LDCFH-DA室溫避光孵育30 min, 經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè), 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以DCF熒光量(FL1)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù)SSC-FSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群, 作不同類型血細(xì)胞的DCF直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的DCF平均熒光量, 細(xì)胞的DCF熒光量與ROS含量成正比。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD), 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 SPSS 13.0進(jìn)行 Tukey單因素方差分析,P＜0.05確認(rèn)為差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞分類與組成比例

圖1A為血細(xì)胞散點(diǎn)圖, 圖1B為等高圖。在等高圖中, 細(xì)胞密度相同的點(diǎn)連成一環(huán)線, 處于中央位置的閉合等高線圈為某類細(xì)胞最集中的區(qū)域, 據(jù)此定義為一類細(xì)胞, 將該區(qū)域進(jìn)行劃定。如圖1所示,根據(jù)血細(xì)胞FSC和SSC特征的不同, 可把雜色鮑血細(xì)胞劃分為三個(gè)亞群: R1, R2和R3。亞群R1的FSC和 SSC值都相對(duì)最小, 表明該亞群的細(xì)胞最小, 顆粒復(fù)雜度也最低, 為透明細(xì)胞; R3亞群細(xì)胞的 FSC和 SSC值都相對(duì)最大, 表明該亞群的細(xì)胞最大, 顆粒復(fù)雜度也最高, 為大顆粒細(xì)胞。R2亞群的細(xì)胞大小和顆粒復(fù)雜度處于R1和R3亞群之間, 為小顆粒細(xì)胞。各類細(xì)胞的FSC和SSC強(qiáng)度見表1, 不同個(gè)體的大顆粒細(xì)胞的比例有較大的差異, 如圖 1所示,A圖的大顆粒細(xì)胞(R3)較少, B圖的較多; 其組成比例的結(jié)果見表2, 順序?yàn)? 小顆粒細(xì)胞＞透明細(xì)胞＞大顆粒細(xì)胞, 三類細(xì)胞之間的比例存在顯著差異(P＜0.05)。

2.2 細(xì)胞凋亡率

圖1 雜色鮑血細(xì)胞SSC-FSC散點(diǎn)圖(A)和等高圖(B)Fig.1 SSC-FSC dot plot (A)and contour plot (B)of H. diversicolor hemocytes

表1 雜色鮑3類血細(xì)胞的大小和顆粒復(fù)雜度(A.U.)Tab.1 Size and granular complexity of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (A.U.)

圖2為雜色鮑新鮮血細(xì)胞Annexin V-FITC/PI凋亡染色散點(diǎn)圖。測(cè)定了10只雜色鮑的血細(xì)胞自然凋亡率, 結(jié)果見表3, 其平均總凋亡和死亡率為3.76%。

表2 雜色鮑3類血細(xì)胞的組成比例(%)Tab.2 Proportion of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (%)

圖2 雜色鮑血細(xì)胞Annexin V-FITC/PI染色凋亡散點(diǎn)圖Fig.2 Apoptosis dot plot of H. diversicolor hemocytes stained with Annexin V-FITC and PI

表3 雜色鮑血細(xì)胞凋亡率(%)Tab.3 Apoptotic ratio of H. diversicolor hemocytes (%)

2.3 吞噬活性

雜色鮑血細(xì)胞吞噬熒光微球的直方圖如圖 3所示, 從圖上可以清晰區(qū)分吞噬1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)及以上熒光微球的血細(xì)胞, 第一個(gè)峰為吞噬 1個(gè)熒光微球的血細(xì)胞(記為 M1), 第二個(gè)峰為吞噬 2個(gè)熒光微球的血細(xì)胞(記為 M2), 其后為吞噬 3個(gè)及以上熒光微球的血細(xì)胞(記為M3), M4為吞噬了1個(gè)及以上熒光微球的血細(xì)胞。血細(xì)胞的吞噬活性如表4所示, 吞噬1個(gè)微球的血細(xì)胞占22.31%; 吞噬2個(gè)微球的血細(xì)胞占16.39%, 個(gè)體差異較大, 最低只有8.17%, 最高可達(dá) 21.76%; 吞噬 3個(gè)及以上微球的血細(xì)胞占24.96%; 總吞噬率為63.67%。

圖3 雜色鮑血細(xì)胞吞噬熒光微球的直方圖Fig.3 Distribution histogram of H. diversicolor hemocytes phagocytosed fluorescent beads

表4 雜色鮑血細(xì)胞的吞噬活性(%)Tab.4 Phagocytic activity of H. diversicolor hemocytes (%)

2.4 線粒體數(shù)量和溶酶體數(shù)量

結(jié)果如表 5所示, 線粒體和溶酶體的數(shù)量均在大顆粒細(xì)胞中最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最少。大顆粒細(xì)胞的線粒體數(shù)量約為小顆粒細(xì)胞的3.4倍, 透明細(xì)胞的 10.4倍; 大顆粒細(xì)胞的溶酶體數(shù)量約為小顆粒細(xì)胞的3.7倍, 透明細(xì)胞的10.2倍。三類細(xì)胞線粒體數(shù)量和溶酶體數(shù)量均存在顯著差異(P＜0.05)。

表5 雜色鮑3類血細(xì)胞的生理特征Tab.5 Physiological characteristics of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (A.U.)

2.5 非特異性酯酶活性和ROS含量

結(jié)果如表 5所示, 酯酶活性在大顆粒細(xì)胞中最高, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最低; 大顆粒細(xì)胞約為小顆粒細(xì)胞的1.2倍, 透明細(xì)胞的5.3倍。ROS含量在大顆粒細(xì)胞中最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最少; 大顆粒細(xì)胞約為小顆粒細(xì)胞的2.7倍, 透明細(xì)胞的17.1倍。三類細(xì)胞線粒體數(shù)量和溶酶體數(shù)量均存在顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

3.1 鮑類血細(xì)胞的分類

對(duì)于鮑類血細(xì)胞的分類, 目前仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)細(xì)胞含有顆粒的情況以及細(xì)胞大小, 可以基本分為兩大類: 顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞(或稱透明細(xì)胞)。王江勇等[5]根據(jù)細(xì)胞大小、顆粒組成特征等將雜色鮑血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞。張劍誠等[15]也將皺紋盤鮑(H. discus hannai)血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞兩大類。Sahaphong等[16]應(yīng)用光鏡和電鏡觀察認(rèn)為耳鮑(H. asinina)血細(xì)胞可分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞。饒小珍等[3]把九孔鮑(H. diversicolor supertexa)血細(xì)胞分為大細(xì)胞、中等細(xì)胞和小細(xì)胞; 透射電鏡下血細(xì)胞可分為兩類: 顆粒細(xì)胞對(duì)應(yīng)于光鏡下的大細(xì)胞和中等細(xì)胞; 無顆粒細(xì)胞對(duì)應(yīng)于光鏡下的小細(xì)胞。有的學(xué)者根據(jù)血細(xì)胞的一些超微結(jié)構(gòu)特征, 將血細(xì)胞類型分得更為細(xì)致。李太武等[2]觀察雜色鮑血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu), 認(rèn)為除了顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞外, 還有一種胞質(zhì)電子密度高、數(shù)量最少的小細(xì)胞。陳全震等[4]通過對(duì)皺紋盤鮑血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的觀察, 將顆粒細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和特殊顆粒細(xì)胞, 無顆粒細(xì)胞分為透明細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。一些外國學(xué)者只觀察到少量顆粒細(xì)胞, 有的研究甚至沒有發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞。Travers等[17]應(yīng)用顯微觀察和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)歐洲鮑(H. tuberculata)血細(xì)胞進(jìn)行了分類研究, 均認(rèn)為其血細(xì)胞主要由透明細(xì)胞和漿樣細(xì)胞組成, 只發(fā)現(xiàn)有極少量的顆粒細(xì)胞,其中漿樣細(xì)胞占 10%。Donaghy等[14]也應(yīng)用顯微觀察和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)盤鮑(H. discus discus)血細(xì)胞分類進(jìn)行了研究, 結(jié)果認(rèn)為血細(xì)胞由透明細(xì)胞和漿樣細(xì)胞組成, 應(yīng)用此兩種方法得出漿樣細(xì)胞所占比例分別為3.82%和6.75%。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù), 根據(jù)血細(xì)胞大小和顆粒復(fù)雜度的差異, 可將血細(xì)胞清晰地分為三個(gè)類群: 大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞, 與饒小珍等[3]對(duì)九孔鮑研究的結(jié)果相似。比較流式細(xì)胞術(shù)和顯微觀察兩種分類方法, 顯微觀察需要對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色處理, 染色效果對(duì)后續(xù)觀察有較大的影響, 血細(xì)胞類型的鑒定也受觀察者的主觀判定影響。相對(duì)而言, 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)量大, 數(shù)據(jù)較為客觀、準(zhǔn)確, 還具有快速簡(jiǎn)便、可同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)或熒光分析等優(yōu)點(diǎn), 但關(guān)于血細(xì)胞類型的劃定, 對(duì)研究人員的分析水平要求也較高。

3.2 鮑類血細(xì)胞的組成比例

對(duì)于鮑類血細(xì)胞的組成比例, 以往的研究結(jié)果也存在一定的差異。王江勇等[5]研究認(rèn)為雜色鮑的顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞分別占55.1%和44.9%; 張劍誠等[15]測(cè)得皺紋盤鮑的顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞分別占40%和 60%; 饒小珍等[3]觀察得出九孔鮑的大細(xì)胞(顆粒細(xì)胞)、中等細(xì)胞(顆粒細(xì)胞)和小細(xì)胞(無顆粒細(xì)胞)分別占3.6%、91.7%和4.7%; 本研究分析得出雜色鮑的大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞分別占8.55%、58.17%和32.71%。

不同類型的血細(xì)胞在功能上存在一定的差異,血細(xì)胞組成比例可能反映了機(jī)體的不同生理和免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)雜色鮑經(jīng)病毒注射感染后, 其顆粒細(xì)胞比例從初始的55%到感染6 h后增加至67%, 然后逐漸下降, 至感染36 h降到45%; 而無顆粒細(xì)胞從初始的45%下降到感染6 h 的33%, 然后逐漸增加,至感染36 h升至55%[18]。因此, 以往的研究得到差異較大的結(jié)果, 可能與物種種類、大小、環(huán)境因素和健康狀態(tài)等有關(guān)。

3.3 血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

血細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異是區(qū)分不同類型血細(xì)胞的主要依據(jù)之一。李太武等[2]應(yīng)用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)雜色鮑顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)電子密度較高, 含有較多顆粒以及細(xì)胞器, 如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等, 而透明細(xì)胞的細(xì)胞器較少。饒小珍等[3]也發(fā)現(xiàn)九孔鮑的顆粒細(xì)胞胞質(zhì)含有豐富的細(xì)胞器, 有較多的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等, 而無顆粒細(xì)胞則只有少量線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。本研究中, 應(yīng)用特異性的探針對(duì)血細(xì)胞的線粒體和溶酶體進(jìn)行標(biāo)記從而分析其數(shù)量, 結(jié)果顯示這兩類細(xì)胞器均在大顆粒細(xì)胞中最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞中最少, 與以往超微觀察的研究報(bào)道一致[2-3]。細(xì)胞器的多寡從側(cè)面反映了各類血細(xì)胞在功能上也存在差異。兩類顆粒細(xì)胞的線粒體較多, 表明它們的生理代謝過程更為活躍, 包括免疫酶類的合成、吞噬作用以及脫顆粒等耗能過程; 較多的溶酶體表明兩類顆粒細(xì)胞對(duì)異物、病原體以及壞死細(xì)胞等的清除能力更強(qiáng), 在免疫過程中擔(dān)當(dāng)更為重要的角色。

3.4 血細(xì)胞的免疫功能

細(xì)胞凋亡是機(jī)體正常細(xì)胞在受到生理和病理性刺激后出現(xiàn)的一種自發(fā)的死亡過程。本研究發(fā)現(xiàn), 正常雜色鮑的血細(xì)胞中也可檢測(cè)到一定的凋亡細(xì)胞, 這是機(jī)體正常新陳代謝的表現(xiàn), 在蝦類的研究中也有相似的結(jié)果[7]。另有研究發(fā)現(xiàn), 貝類在受到環(huán)境污染物脅迫后,血細(xì)胞會(huì)受到毒性損傷, 從而被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡[12,19],雖然細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除損傷細(xì)胞的重要過程, 但血細(xì)胞凋亡率的持續(xù)上升可能會(huì)引起血細(xì)胞數(shù)量的下降,從而導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降, 甚至危及生命[20]?？梢? 血細(xì)胞凋亡在環(huán)境毒理學(xué)和免疫學(xué)研究中都是一個(gè)重要的敏感指標(biāo), 在往后的研究中可加以重視。

吞噬作用是血細(xì)胞的主要免疫功能之一, 對(duì)異物、病原體以及自身的壞死細(xì)胞、碎片等進(jìn)行清除。由于流式細(xì)胞術(shù)具有準(zhǔn)確、快捷、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn), 已被應(yīng)用于多種貝類血細(xì)胞吞噬作用研究中[9,13-14,21]。本研究根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所建立的測(cè)定條件, 對(duì)雜色鮑血細(xì)胞的總體吞噬情況進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示總吞噬率為 54.32%～75.17%, 吞噬一個(gè)微球的血細(xì)胞占15.74%～28.80%。有的國外學(xué)者認(rèn)為為了減少非特異性粘附所帶來的誤差, 應(yīng)以吞噬三個(gè)及以上微球的血細(xì)胞的比例來衡量吞噬活性[9,14,21], 本研究中測(cè)得該比例達(dá)到了 20.03%～31.64%, 可見本研究的測(cè)定條件同樣適用于此衡量標(biāo)準(zhǔn)。大部分貝類研究報(bào)道認(rèn)為吞噬作用主要由顆粒細(xì)胞完成, 透明細(xì)胞也具有一定的吞噬能力[22-23]。在本研究中, 由于血細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用, 細(xì)胞發(fā)生了變形, 其大小和顆粒度發(fā)生不同程度的改變, 另外由于吞噬過程被激活,血細(xì)胞的脫顆粒免疫反應(yīng)也可能被進(jìn)一步激活, 也對(duì)血細(xì)胞的大小和顆粒復(fù)雜度產(chǎn)生影響, 從而在FSC-SSC散點(diǎn)圖中難以區(qū)分各類血細(xì)胞, 因此本研究未能對(duì)不同類型血細(xì)胞的吞噬活性進(jìn)行分析。

非特異性酯酶普遍存在于各類細(xì)胞中, 是溶酶體酶類之一, 參與對(duì)異物、病原體的殺傷及清除。細(xì)胞化學(xué)研究顯示九孔鮑各類血細(xì)胞中均含有非特異性酯酶, 總陽性率達(dá) 86.3%[3]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分析, 也表明雜色鮑各類血細(xì)胞均具有非特異性酯酶活性, 且在各類血細(xì)胞中存在差異, 兩類顆粒細(xì)胞顯著高于透明細(xì)胞, 此結(jié)果與溶酶體數(shù)量的結(jié)果相吻合。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)包括超氧陰離子(O2–)、過氧化氫( H2O2)和羥自由基(·OH)等, 是機(jī)體進(jìn)行防御殺菌的重要物質(zhì)。血細(xì)胞在自然生理?xiàng)l件下也存在一定量的ROS, 當(dāng)病菌入侵時(shí), ROS含量會(huì)迅速上升, 以進(jìn)行免疫殺菌, 此過程稱為呼吸爆發(fā)[23]。研究表明鮑類血細(xì)胞經(jīng)細(xì)菌、病毒或抗原物質(zhì)刺激后, 均會(huì)產(chǎn)生大量的ROS進(jìn)行免疫防御[15,18,24]。本研究對(duì)自然生理狀態(tài)下雜色鮑各類血細(xì)胞的非誘導(dǎo)性 ROS含量進(jìn)行比較, 結(jié)果顯示大顆粒細(xì)胞的 ROS含量最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最少。線粒體數(shù)量、溶酶體數(shù)量、非特異性酯酶以及ROS含量均得到了一致的結(jié)果, 表明兩類顆粒細(xì)胞在鮑類的免疫防御過程中可能發(fā)揮更為重要的作用。

[1]黃勇超, 劉志昕. 鮑非特異性免疫研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(1): 51-54.

[2]李太武, 李曄, 蘇秀榕. 雜色鮑的血細(xì)胞[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2007, 31(增刊): 12-17.

[3]饒小珍, 陳寅山, 林崗, 等. 九孔鮑血細(xì)胞的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 23(3): 71-76.

[4]陳全震, 楊俊毅, 王小谷, 等. 皺紋盤鮑血細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)及分類研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2001, 25(6): 492-494.

[5]王江勇, 郭志勛, 馮娟, 等. 雜色鮑血細(xì)胞的分類及顯微與超微結(jié)構(gòu)研究[J].臺(tái)灣海峽, 2008, 27(2): 156-160.

[6]冼健安, 茍妮娜, 陳曉丹, 等. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蝦類血細(xì)胞活性氧含量方法的建立[J].海洋科學(xué), 2012, 36(2): 29-33.

[7]冼健安, 王安利, 苗玉濤. 流式細(xì)胞術(shù)在克氏原螯蝦血細(xì)胞的分類、活性和免疫功能中的應(yīng)用[J].淡水漁業(yè),2012, 42(1): 9-14.

[8]冼健安, 王安利. 飼料中銅離子對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞組成、活性和免疫功能的影響[J].海洋科學(xué), 2013, 37(2): 40-46.

[9]Bado-Nilles A, Gagnaire B, Thomas-Guyon H, et al.Effects of 16 pure hydrocarbons and two oils on haemocyte and haemolymphatic parameters in the Pacific oyster,Crassostrea gigas(Thunberg)[J].Toxicology in Vitro, 2008, 22(6): 1610-1617.

[10]Brousseau P, Pellerin J, Morin Y, et al. Flow cytometry as a tool to monitor the disturbance of phagocytosis in the clamMya arenariahemocytes following in vitro exposure to heavy metals[J].Toxicology, 2000, 142: 145-156.

[11]Gagnaire B, Thomas-Guyon H, Renault T. In vitro effects of cadmium and mercury on Paci fi c oyster,Crassostrea gigas(Thunberg), haemocytes[J].Fish & Shell fi sh Immunology, 2004, 16: 501-512.

[12]王清, 楊紅生, 王曉宇. 鎘和苯并芘脅迫對(duì)文蛤血細(xì)胞功能的影響[J].海洋科學(xué), 2010, 34(9): 82-86.

[13]李進(jìn)壽, 陳軍, 唐艷霞, 等. 利用流式細(xì)胞儀技術(shù)研究雜色鮑血細(xì)胞的吞噬率[J].臺(tái)灣海峽, 2010, 29(4): 460-465.

[14]Donaghy L, Hong H, Lambert C, et al. First characterisation of the populations and immune-related activities of hemocytes from two edible gastropod species,the disk abalone,Haliotis discus discusand the spiny top shell,Turbo cornutus[J].Fish & Shellfish Immunology,2010, 28: 87-97.

[15]張劍誠, 張峰, 王吉橋. 皺紋盤鮑血細(xì)胞分類及活性氧產(chǎn)生機(jī)理的研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 19(3):182-188.

[16]Sahaphong S, Linthong V, Wanichano C, et al. Morphofunctional study of the hemocyte ofHaliotis asinine[J].Joumal of Shellfish Research, 2001, 20(1): 51-54.

[17]Travers M, da Silva P M, Go?c N L, et al. Morphologic,cytometric and functional characterisation of abalone(Haliotis tuberculata)haemocytes[J].Fish & Shellfish Immunology, 2008, 24: 400-411.

[18]王江勇, 郭志勛, 馮娟, 等. 雜色鮑血細(xì)胞免疫特點(diǎn)及免疫功能的研究[J].熱帶海洋學(xué)報(bào), 2010, 29(3): 71-76.

[19]劉靜, 潘魯青, 朱現(xiàn)曄. 苯并(a)芘對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞損傷與凋亡的研究[J].海洋環(huán)境科學(xué), 2011, 30(2): 153-157.

[20]Xian J A, Wang A L, Chen X D, et al. Cytotoxicity of nitrite on haemocytes of the tiger shrimp,Penaeus monodon, using flow cytometric analysis[J].Aquaculture,2011, 317: 240-244.

[21]Donaghy L, Kim B, Hong H, et al. Flow cytometry studies on the populations and immune parameters of the hemocytes of the Suminoe oyster,Crassostrea ariakensis[J].Fish &Shell fi sh Immunology, 2009, 27: 296-301.

[22]馬洪明, 麥康森. 貝類血細(xì)胞的吞噬作用和非我識(shí)別[J].海洋科學(xué), 2003, 27(2): 16-18.

[23]孫敬鋒, 吳信忠. 貝類血細(xì)胞及其免疫功能研究進(jìn)展[J].水生生物學(xué)報(bào), 2006, 30(5): 601-607.

[24]張峰, 李光友, 張培軍. 皺紋盤鮑血細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的研究[J].中國水產(chǎn)科學(xué), 1999, 6(3): 36-40.