崔紅，賈文斌，楊奇，馮亞非

黃芪治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的抗氧化機制研究

崔紅，賈文斌，楊奇，馮亞非

目的：研究黃芪改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的具體機制。方法：選用32只3月齡SD雌性大鼠，隨機分為假手術(shù)組、單純?nèi)萁M、黃芪治療組和抗氧化劑組。后3組卵巢切除術(shù)后4周分別給予相應(yīng)制劑灌胃，12周處死動物取材，檢測血清和骨組織氧化應(yīng)激水平［丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）］、股骨骨密度和骨代謝指標(biāo)［堿性磷酸酶（ALP）、血鈣（Ca）、血磷（P）和骨鈣素（OC）］。結(jié)果：單純?nèi)萁M的血清和骨組織中氧化應(yīng)激水平比假手術(shù)組升高（P＜0.01），而股骨骨密度降低（P＜0.01）。與單純?nèi)萁M比較，黃芪治療組和抗氧化劑組血清和骨組織中氧化應(yīng)激水平降低（P＜0.01），同時股骨骨密度升高（P＜0.05），ALP和OC降低（P＜0.05）。結(jié)論：黃芪水提液能夠通過抗氧化效應(yīng)有效改善去卵巢大鼠的骨量丟失和骨代謝。

黃芪；骨質(zhì)疏松；骨密度；動物實驗

（J Int Obstet Gynecol，2015，42：504-507）

骨質(zhì)疏松（osteoporosis）是一種以骨量降低和骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，進(jìn)而導(dǎo)致骨脆性增加及骨折易發(fā)的代謝性骨?。?］。據(jù)統(tǒng)計，中國每年有接近九千萬骨質(zhì)疏松患者。絕經(jīng)后女性由于雌激素水平下降以及飲食、遺傳、藥物、運動等諸多原因，發(fā)病率明顯較男性高［2-3］。隨著當(dāng)前社會人口的老齡化趨勢加劇，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis， PO）所致骨折的發(fā)病率也呈現(xiàn)幾何級數(shù)的遞增趨勢，并由此帶來了極大的家庭及社會負(fù)擔(dān)［4］。多項研究證實中藥在骨骼系統(tǒng)疾病的治療中擁有良好的療效和廣闊的應(yīng)用前景［5-7］。近期研究發(fā)現(xiàn)以黃芪為主藥的各種復(fù)方制劑能夠提高骨密度，改善骨代謝，同時提高性激素水平，從而有效緩解骨質(zhì)疏松的臨床癥狀［8］。但是，目前尚缺乏黃芪治療骨質(zhì)疏松具體機制的相關(guān)研究?？紤]到近年來一系列報道均證實氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）在骨質(zhì)疏松的發(fā)病進(jìn)程中起到了至關(guān)重要的作用［9-10］，本實驗觀察黃芪對去卵巢大鼠骨密度及血液和骨組織中氧化應(yīng)激水平，探索黃芪對骨量的影響及治療骨質(zhì)疏松的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及藥物SPF級3個月齡雌性未育Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，體質(zhì)量（230±15）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。黃芪水提液由第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系從膜莢黃芪（astragalus membranaceus，AM）中提取，具體提取方法為：100 g黃芪，加蒸餾水至浸過藥材，加熱沸騰40 min后提取藥液備用。藥材再次加蒸餾水加熱沸騰30 min后提取藥液備用。藥材第3次加蒸餾水加熱沸騰20 min。然后將3次濾液合并，以3 000 r/min離心5 min，留取上清液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在80℃，-0.08 MPa（1 MPa=7.5×103mmHg）條件下將上清液濃縮至60 mL。將濃縮液在100 mL容量瓶中定容，即配置成相當(dāng)于1 g/mL的藥材。戊巴比妥鈉由科昊生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)?？寡趸瘎㎞-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）抗氧化機制主要有以下兩個方面：①NAC作為小分子物質(zhì)易于進(jìn)入細(xì)胞，脫乙?；蟪蔀楣入赘孰暮铣傻那绑w，促進(jìn)谷胱甘肽的合成，提高組織內(nèi)谷胱甘肽含量，增強組織的抗自由基及抗藥物、毒物損傷的能力。②NAC分子中的活性巰基（-SH）可對抗不同原因所致的組織氧化損傷。對體內(nèi)氧自由基（超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等）具有明顯的拮抗作用；由于NAC易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對能透過細(xì)胞膜與多種細(xì)胞成分（如蛋白質(zhì)、DNA、氨基酸等）反應(yīng)、導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死的氧自由基具有抑制、清除作用。NAC為美國Sigma公司生產(chǎn)，使用生理鹽水將其配制成0.5 mg/mL水溶液。

1.2方法

1.2.1動物模型及給藥將32只大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組、單純?nèi)萁M、黃芪治療組和抗氧化劑組，每組8只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后以2％戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，備皮、消毒鋪單后背側(cè)雙切口入路切開腹膜，進(jìn)入腹腔，暴露卵巢。假手術(shù)組僅在暴露卵巢后，切除其周圍約1 cm3大小脂肪組織，不切除卵巢。其余3組用平鑷將卵巢牽出，在輸卵管與子宮角交界處結(jié)扎，摘除卵巢。術(shù)后4周開始假手術(shù)組和單純?nèi)萁M采用生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，黃芪治療組灌胃給予200 mg/（kg·d）黃芪水提取液，抗氧化劑組灌胃給予5 mg/（kg·周）抗氧化劑溶液，共持續(xù)8周。4組動物在同一環(huán)境下飼養(yǎng)60 d，每周稱動物體質(zhì)量1次。術(shù)后12周麻醉大鼠，開胸，直視下左心室穿刺取血6 mL，2 500 r/min離心10 min分離血清，-80℃冷凍保存。剖取雙側(cè)股骨，剔除周圍軟組織，用生理鹽水洗凈。右側(cè)股骨放入多聚甲醛保存，左側(cè)股骨洗凈后用液氮速凍后測定骨組織氧化應(yīng)激水平。

1.2.2血清氧化應(yīng)激水平測定解凍血清，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）；黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）。試劑盒均由南京建成生物工程公司提供，按使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.3骨組織氧化應(yīng)激水平測定將液氮中的骨組織稱重后，采用錘式組織粉碎器擊打，迅速將骨組織轉(zhuǎn)入裝有液氮的研缽中，將骨組織碎塊磨成粉末狀。然后將粉末狀骨組織收集到1.5 mL的離心管中，向EP管中加入蛋白裂解液，在冰上裂解骨組織30 min。4℃離心取上清即為含有總蛋白的提取液。用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測抗氧化酶錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和過氧化氫酶（Catalase）的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.4骨密度測定將多聚甲醛中的標(biāo)本取出洗凈，通過美國HOLOGIC公司雙能X線吸收骨密度儀（DEXA）測量，用單位面積上的骨礦含量進(jìn)行表示。股骨的X線掃描區(qū)域被等距離地分為3等份：近端、中端和遠(yuǎn)端，取3個區(qū)域的平均值作為股骨的骨密度數(shù)值。

1.2.5骨代謝生化指標(biāo)的測定將血液標(biāo)本送至第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗科，測定血清中骨代謝生化指標(biāo)的水平，包括堿性磷酸酶（ALP）、血鈣（Ca）、血磷（P）和骨鈣素（OC）。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad Prism 6.0.1統(tǒng)計分析軟件處理實驗結(jié)果。定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。多組間比較及組間兩兩比較均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血清氧化應(yīng)激水平的比較單純?nèi)萁M大鼠較假手術(shù)組MDA水平升高，SOD降低（均P＜0.01）。而與單純?nèi)萁M相比，黃芪治療組和抗氧化劑組血清MDA降低，SOD增加（P＜0.01）。見表1。

表1　各組大鼠血清氧化應(yīng)激水平的比較（±s）

表1　各組大鼠血清氧化應(yīng)激水平的比較（±s）

組別　n　MDA（nmol/L）　SOD（U/mL）假手術(shù)組①　8　03.02±0.69　249.30±35.10單純?nèi)萁M②　8　11.35±2.12　120.30±20.90黃芪治療組③　8　07.23±1.07　191.00±24.80抗氧化劑組④　8　06.14±1.14　203.70±27.50 F（P）　55.200（＜0.001）　30.000（＜0.001）組間比（P）①∶②　＜0.001?。?.001①∶③?。?.001　0.001①∶④?。?.001　0.013②∶③　＜0.001?。?.001②∶④　＜0.001?。?.001③∶④　0.383　0.794

2.2各組大鼠骨組織氧化應(yīng)激水平和骨密度的比較各組大鼠骨組織中MnSOD和Catalase的電泳圖，見圖1。單純?nèi)萁M骨組織中的抗氧化酶MnSOD 和Catalase的表達(dá)較假手術(shù)組降低（P＜0.01），而與單純?nèi)萁M相比，黃芪治療組和抗氧化劑組增加了兩種抗氧化酶的表達(dá)（P＜0.01）。見表2。單純?nèi)萁M的股骨骨密度比假手術(shù)組降低（P＜0.01），黃芪治療組和抗氧化劑組骨密度較單純?nèi)萁M升高（P＜0.05），但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。2.3各組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)的比較與假手術(shù)組比較，單純?nèi)萁MALP和OC的測定值升高（P＜0.01），與單純?nèi)萁M相比，黃芪治療組和抗氧化劑組ALP和OC的測定值降低（P＜0.05）；4組間Ca和P差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖1　各組大鼠骨組織中MnSOD和Catalase的電泳圖

表2　各組大鼠骨組織氧化應(yīng)激水平和骨密度的比較（±s）

表2　各組大鼠骨組織氧化應(yīng)激水平和骨密度的比較（±s）

組別　n　MnSOD　Catalase　骨密度（g/cm2）假手術(shù)組①　8　0.97±0.11　1.12±0.06　0.21±0.03單純?nèi)萁M②　8　0.48±0.08　0.32±0.08　0.15±0.02黃芪治療組③　8　0.80±0.06　0.90±0.08　0.19±0.02抗氧化劑組④　8　0.85±0.09　0.97±0.07　0.18±0.01 F（P）　35.000（＜0.001）143.000（＜0.001）11.110（＜0.001）組間比（P）①∶②?。?.001?。?.001?。?.001①∶③　0.017?。?.001　0.257①∶④　0.114　0.010　0.040②∶③?。?.001　＜0.001　0.004②∶④?。?.001?。?.001　0.040③∶④　0.785　0.354　0.782

表3　各組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)的比較（±s）

表3　各組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)的比較（±s）

組別　ALP（U/L）　Ca（mmol/L） P（mmol/L）　OC（ng/mL）假手術(shù)組①　80.90±13.30　2.44±0.50　1.90±0.26　8.21±2.62單純?nèi)萁M②124.80±18.10　2.40±0.36　1.98±0.30　12.93±2.06黃芪治療組③102.10±15.20　2.31±0.44　2.06±0.32　9.49±2.60抗氧化劑組④100.50±15.00　2.38±0.41　2.02±0.35　9.85±2.54 F 10.700　0.128　0.390　143.000 P 0.001　0.943　0.761?。?.001組間比（P）①∶②?。?.001　-　-　0.003①∶③　0.049　-　-　0.729①∶④　0.077　-　-　0.552②∶③　0.032　-　-　0.044②∶④　0.020　-　-　0.042③∶④　0.997　-　-　0.991

3　討論

中老年女性由于骨量峰值較低和絕經(jīng)后雌激素水平顯著下降，很容易發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，其并發(fā)癥嚴(yán)重，資源消耗大，給患者本人及家庭和社會造成沉重負(fù)擔(dān)，已成為全球性的健康問題。目前臨床上應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥物，雖然可以取得一定療效，但是均屬替代治療，且費用昂貴。長期用藥還會造成患者依從性差，藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率增加［11-12］。中藥在治療骨質(zhì)疏松方面，具有整體調(diào)節(jié)、不良反應(yīng)小、價格低廉等優(yōu)點，已引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。由于骨質(zhì)疏松在中醫(yī)辨證屬骨痿范疇，病機為腎精虧虛、脾腎氣虛。

黃芪作為一種傳統(tǒng)中藥，含有多糖、苷類、黃酮和微量元素等多種成分。記載中有補中健脾腎，以益氣血生化之效。多項實驗研究表明：黃芪水提液能減少骨吸收，增加骨形成，從而有效防止去卵巢大鼠的骨丟失［8，13］；此外，還能夠促進(jìn)腸道對鈣的吸收、減少腎對鈣磷的排泄，改善骨代謝。臨床研究方面，陽波等［14］用黃芪治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，腰椎和股骨骨密度顯著增高，腎虛癥狀評分顯著降低，骨代謝指標(biāo)顯著改善，提示黃芪治療可以有效阻止絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨量丟失，改善腎虛癥狀。在本研究中使用黃芪水提液顯著提高了去卵巢大鼠的骨密度，降低血清ALP和OC水平。盡管黃芪治療骨質(zhì)疏松的效果得到了多方面的驗證，但其具體的改善機制尚不清楚。目前多認(rèn)為可能與提高性激素水平、改善成骨細(xì)胞功能、提高機體微量元素含量有關(guān)，但是仍然缺乏更加深入的機制研究。

雌激素水平下降一直以來被認(rèn)為是女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要機制［15］。因此補腎中藥能提升和維持機體性激素水平，改善骨質(zhì)疏松，這一理論得到多項研究的證實［16］。但是，近年來的研究證實：氧化應(yīng)激中過量產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可能才是最重要的致病因素，也由此產(chǎn)生了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病機制由“雌激素為中心”向“氧化應(yīng)激為中心”轉(zhuǎn)移的相關(guān)理論［9］。氧化應(yīng)激會影響成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞的產(chǎn)生及活性［17-18］。Almeida等［19］研究發(fā)現(xiàn)ROS的大量產(chǎn)生能阻斷細(xì)胞內(nèi)的β-catenin/Wnt信號通路，影響了成骨細(xì)胞的功能和活性。另外，抗氧化系統(tǒng)所提供的抗氧化能力也是維持骨骼穩(wěn)態(tài)所必不可少的。而絕經(jīng)后女性骨質(zhì)中抗氧化應(yīng)激能力的下降，誘發(fā)了急性期雌激素缺乏時骨吸收的發(fā)生。抗氧化治療能有效改善成骨細(xì)胞的活性和骨密度，這就為改善骨質(zhì)疏松提供了新的思路和策略。

黃芪能夠抑制多種組織器官中的氧化應(yīng)激水平［20-21］。本實驗發(fā)現(xiàn)，加入黃芪降低了去卵巢大鼠血清和骨組織中的氧化應(yīng)激指標(biāo)，其效果與抗氧化劑組相似。另外，黃芪對骨密度及骨代謝的改善作用也與抗氧化劑干預(yù)后相似，這些證據(jù)提示黃芪可能是通過抑制氧化應(yīng)激來改善骨質(zhì)疏松的。另外，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪促進(jìn)了線粒體內(nèi)的抗氧化酶MnSOD和Catalase的表達(dá)，表明黃芪是通過改善線粒體的功能來抑制氧化應(yīng)激的?？傊?，由于中藥成分非常復(fù)雜，一種中藥就含有多種成分，其作用機制可能與多種因素有關(guān)。因此，探索黃芪對骨質(zhì)疏松的詳細(xì)改善機制，有利于更好地分析其中具體的作用成分，從而為該藥物的提純和產(chǎn)品化提供更好的理論和實驗指導(dǎo)。

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The Anti-oxidative Effect of Astragalus Membranaceus on Postmenopausal Osteoporosis

CUI Hong，JIA Wen-bin，YANG Qi，F(xiàn)ENG Ya-fei.
Department of Gynecology（CUI Hong），Department of Pharmacy（JIA Wen-bin），The First Sanatorium of Jinan Military Area Command，Qingdao 266071，Shandong Province，China；School of Pharmacy，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China（YANG Qi）；Department of Orthopaedic Surgery，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China（FENG Ya-fei）

FENG Ya-fei，E-mail：fengyafei2005@163.com

Objective：To study the specific mechanisms underlying the improvement of astragalus membranaceus（AM）on postmenopausal osteoporosis.Methods：A total of 40 three-month-old female SD rats were randomly divided into four groups: sham group，ovariectomized（OVX）group，the AM group，and the antioxidant group.Four weeks after surgery，each group was respectively given their treatment by gavage.Animals were sacrificed at 12 weeks，and levels of oxidative stress in serum and bone tissue，femur bone density and bone metabolism were analyzed.Results：Significantly higher oxidative stress level and lower bone mineral density were observed in the OVX group than that in the sham group（all P＜0.01）.Compared with the OVX group，AM group and antioxidant group showed significantly reduced oxidative stress level（P＜0.01），while the femur bone density was significantly increased（P＜0.05）and alkaline phosphatase and osteocalcin were significantly decreased（both P＜0.05）.Conclusions：AM extract can effectively improve bone loss and bone metabolism in ovariectomized rats，and this improvement was achieved by its antioxidant effect.

Astragalus membranaceus；Osteoporosis；Bone density；Animal experimentation

2015-02-09）

［本文編輯王琳］

國家自然科學(xué)基金（8140090146）

266071山東省青島市，濟南軍區(qū)第一療養(yǎng)院婦科（崔紅），藥劑科（賈文斌）；第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系（楊奇）；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科（馮亞非）

馮亞非，E-mail：fengyafei2005@163.com