丁海燕+張國(guó)發(fā)+武燕+馮偉

摘 要：自然界中某些微生物具有較強(qiáng)的酚降解能力，利用微生物處理含酚廢水的方法受到了越來越廣泛的重視。該文通過梯度平板法從石化工業(yè)廢水中分離篩選得到3株降解酚的細(xì)菌，苯酚降解率分別為90.9%、82.5%、74.9%。對(duì)其進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而將其應(yīng)用到工廠等污水處理方面，降低含苯酚的廢水排出，具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：石化工業(yè)污水；苯酚降解菌；降解率

中圖分類號(hào) X505 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）17-33-03

Isolation and Screening of Phenol Degrading Bacteria and its Degradation Rate in Petrochemical Industry Wastewater

Ding Haiyan et al.

（Daqing Normal University，Daqing 163712，China）

Abstract：Some microorganisms in nature have a strong ability to degrade phenol. The method of treating phenol wastewater by microorganism has been paid more and more attention. In this article，three strains of bacteria were isolated and screened from the petrochemical industrial wastewater by gradient plate method.The degradation rate of phenol was 90.9%，82.5% and 74.9%. It has guiding significance for further study，and then appling to the plant and other wastewater treatment，reducing the wastewater containing phenol wastewater discharge.

Key words：Petrochemical industrial wastewater；Phenol-degrading bacteria；degradation rate

含酚廢水主要來自各類化工廠以及合成有機(jī)農(nóng)藥、染料等生產(chǎn)過程中，未經(jīng)及時(shí)處理或分解，直接排放到河流中，造成了水源污染。酚是一種有毒物質(zhì)，能與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，濃度小時(shí)可使細(xì)胞變性，濃度大時(shí)可使蛋白質(zhì)凝結(jié)，酚類化合物都具有氣味，有酸性，在空氣中容易被氧化。含酚廢水對(duì)環(huán)境的危害極大，造成了嚴(yán)重的水污染，在許多工業(yè)領(lǐng)域的廢水中均含有苯酚。目前常用的苯酚的清除方法有如下2種，物理化學(xué)藥劑的費(fèi)用高，易造成再次污染；微生物處理含酚廢水的方法費(fèi)用少、效果好。研究表明，自然界中某些微生物具有很強(qiáng)的降解苯酚能力，微生物法處理苯酚方法越來越被廣泛應(yīng)用。近年來，從被酚類物質(zhì)污染的環(huán)境中分離到了多種降酚微生物菌株，如假絲酵母（Candida Albicans）[1]、假單胞菌（Pseudomonadaceae）[2]、醋酸鈣不動(dòng)桿菌（A.calcoaceticus）[3]、根瘤菌（Rhizobium）[4]、藻類[5]、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌（Alcaligeneseutrophus）[6]等。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源 從大慶某化工廠取出的含酚廢水，裝入無(wú)菌的玻璃瓶中，拿回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種的分離。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基及試劑 （1）耐酚細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏6g/L，蛋白胨12g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂16g/L，pH為7左右，121℃滅菌20min。（2）苯酚無(wú)機(jī)培養(yǎng)液：MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.3g/L，pH7.0～7.2，苯酚25mg，蒸餾水100mL，分裝三角瓶，每瓶30mL，121℃滅菌20min。（3）碳源對(duì)照培養(yǎng)液A：葡萄糖25～75mg，尿素0.1g，微量元素10mL，蒸餾水90mL，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。（4）微量元素溶液：MgSO4.7H2O 0.3g/L，KH2PO4 0.3g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005g/L，CaCl2 0.005g/L。（5）苯酚培養(yǎng)液B：苯酚25～75mg，尿素0.1g，微量元素10mL，蒸餾水90mL，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。（6）無(wú)菌生理鹽水：濃度為9%的鹽水，121℃滅菌20min。

1.2 方法

1.2.1 梯度平板法分離 （1）梯度平板的制備：量取12mL不含苯酚的無(wú)菌耐酚培養(yǎng)基倒入直徑為9mL的培養(yǎng)皿中，然后立刻將此培養(yǎng)皿斜著放置，讓培養(yǎng)基固定成斜面狀，并讓培養(yǎng)基覆蓋平板底部，凝固后放平，再加入12mL無(wú)菌的含苯酚耐酚細(xì)菌培養(yǎng)基，正好凝固成平面。（2）樣品液稀釋：將采集的含酚廢水樣品作10倍系列稀釋。（3）涂布平板：用1mL移液管分別吸上述10-3、10-2、10-1和原液4種樣品液0.1mL，滴在上述相應(yīng)的梯度平板上，用涂布棒涂布菌液，使菌液分散開來，每種濃度作3個(gè)重復(fù)。（4）培養(yǎng)：將上述涂布了樣品液的平板倒置于30°恒溫箱中培養(yǎng)1～2d。（5）涂布法分離結(jié)果觀察：從30℃恒溫箱中取出分離平板，觀察平板上耐酚細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。（6）耐酚細(xì)菌純化：用無(wú)菌接種環(huán)挑取苯酚高濃度一側(cè)單菌落的菌苔在含苯酚的耐酚細(xì)菌平板上三區(qū)劃線純化，培養(yǎng)后挑取單菌落接種到耐酚細(xì)菌斜面上，30℃培養(yǎng)3d。

1.2.2 耐酚細(xì)菌分離純化及馴化 將采集的含酚廢水加入含30mL苯酚無(wú)機(jī)培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃培養(yǎng)3～5d，再添加3次苯酚無(wú)機(jī)培養(yǎng)液，從中選出在苯酚中能存活下來的菌株，對(duì)其進(jìn)行馴化。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 （1）標(biāo)記：取5支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即：0、12、24、36h和48h。（2）接種：分別用5mL無(wú)菌吸管吸取2.5mL過夜培養(yǎng)液（培養(yǎng)10～12h）轉(zhuǎn)入盛有30mL碳源對(duì)照液A和苯酚培養(yǎng)液B的三角燒瓶中，混合均勻后分別取5mL混合液放入上述標(biāo)記的5支無(wú)菌大試管中。（3）培養(yǎng)：將已接種的試管置搖床30℃振蕩培養(yǎng)48h（振蕩頻率4 000r/min），分別培養(yǎng)0、12、24、36和48h，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁，測(cè)定其光密度值。（4）比濁測(cè)定：用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定。從中取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值在0.1～0.65（測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布）。

1.2.4 性能測(cè)定 （1）初篩。含不同苯酚B平板制備：按常規(guī)方法制備，苯酚終濃度分別為25mg/100mL、45mg/100mL、60mg/100mL、75mg/100mL。將分離純化的耐酚能力強(qiáng)的菌株分別劃線接種于上述制備的平板上，30℃培養(yǎng)1～2d。（2）復(fù)篩。用無(wú)菌接種環(huán)挑取一環(huán)經(jīng)初篩獲得的菌種菌苔轉(zhuǎn)接于含30mL不含苯酚的耐酚細(xì)菌培養(yǎng)液的三角燒瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)1d后，將培養(yǎng)液離心5min，留沉淀，用生理鹽水離心沖洗1次，最后用無(wú)菌生理鹽水制備一定濃度的菌懸液。

1.2.5 苯酚降解率測(cè)定 以高濃度苯酚培養(yǎng)液中生長(zhǎng)速度下降不明顯者為出發(fā)菌株，接入含苯酚培養(yǎng)液B的三角燒瓶中，振蕩培養(yǎng)48h，并分別于0h和48h測(cè)定發(fā)酵液苯酚濃度，計(jì)算苯酚降解率。計(jì)算公式如下：

苯酚降解率（%）=（未酵前發(fā)酵液苯酚含量-發(fā)酵終止時(shí)發(fā)酵液苯酚含量）/未發(fā)酵前發(fā)酵液苯酚含量×100

1.2.6 發(fā)酵液中苯酚含量的測(cè)定 發(fā)酵液中苯酚具有在NH4OH-NH4Cl緩沖液中游離出來的特點(diǎn)。當(dāng)游離出來的苯酚與4-氨基安替比林混合時(shí)，兩者可發(fā)生縮合反應(yīng)。在氧化劑鐵氰化鉀作用下，酚被氧化成醌，并于4-氨基安替比林偶合而顯色。將適量發(fā)酵液加入到50mL容量瓶中，同時(shí)分別吸取酚標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1、2、3、4和5mL于各容量瓶中，用蒸餾水稀釋至50mL，然后向酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和發(fā)酵的稀釋溶液中各加入0.25mL20%氨性氯化銨緩沖液、0.5mL2%4-氨基安替比林溶液和0.5mL8%鐵氰化鉀溶液，每次加入試劑后需混勻，放置15min后在A510處比色測(cè)定苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線圖中可查出發(fā)酵液中苯酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及馴化結(jié)果 共篩選出3株對(duì)苯酚具有降解能力的菌落，分別編號(hào)為W1、W2、W3。3個(gè)菌株的菌落的形狀、透明度、顏色、邊緣、高度等形態(tài)特征，如表1所示。

表1 菌落的形態(tài)特征

[菌株＼&形狀＼&透明度＼&顏色＼&邊緣＼&高度＼&W1

W2

W3＼&不規(guī)則圓

不規(guī)則圓

圓形＼&周圍透明

不透明

不透明＼&中間褐色

乳白

金黃色＼&不整齊

不整齊

整齊＼&矮

較高

較高＼&]

2.2 苯酚降解細(xì)菌生長(zhǎng)情況及苯酚降解率分析 將菌懸液接入含30mL苯酚培養(yǎng)液B的三角燒瓶中（接種量為50mg濕菌體/100mL培養(yǎng)液），30℃振蕩培養(yǎng)48h。期間分別于發(fā)酵的0h、12h、24h、36h、48h取樣測(cè)定光密度值，并繪制出生長(zhǎng)曲線，見圖1，在25mg/100mL苯酚培養(yǎng)液中生長(zhǎng)速度下降不明顯者為耐酚菌株。從圖1中曲線的趨勢(shì)并沒有明顯下降可以看出此細(xì)菌具有降解苯酚的能力，而曲線末端有一點(diǎn)下降的趨勢(shì)，則是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)液中有少部分的細(xì)菌死亡。

[時(shí)間（h）]

圖1 不同時(shí)間苯酚溶液耐酚細(xì)菌OD值

W1菌株在苯酚為75mg/100mL的平板上有大量菌落生長(zhǎng)，根據(jù)圖2可計(jì)算出苯酚降解率為91%～100%，W2菌株在苯酚為60mg/100mL的平板上有大量菌落生長(zhǎng)，根據(jù)圖2可計(jì)算出苯酚降解率為81%～90%，W3號(hào)菌株在苯酚為45mg/100mL的平板上有大量菌落生長(zhǎng)，根據(jù)圖2可計(jì)算出苯酚降解率為71%～80%，如表2所示。

[0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0][OD值][苯酚含量（mg）][0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06]

圖2 不同酚含量標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD值

表2 耐酚細(xì)菌生長(zhǎng)情況及苯酚降解率

[菌株＼&不同含酚濃度平板上生長(zhǎng)情況＼& 苯酚降解率 ＼&0.025%＼&0.045%＼&0.060%＼&0.075%＼&<70%＼&71%～80%＼&81%～90%＼&91%～100%＼&W1＼&+＼&+＼&++＼&+++＼&＼&＼&＼&√＼&W2＼&+＼&++＼&+++＼&++＼&＼&＼&√＼&＼&W3＼&++＼&+++＼&++＼&+＼&＼&√＼&＼&＼&]

注：“-”表示沒有菌落生長(zhǎng)，“+”表示有少數(shù)菌落生長(zhǎng)，“++”表示有中等菌落生長(zhǎng)“+++”有大量菌落生長(zhǎng)。

3 展望

本文分離純化得到3株具有較強(qiáng)降解酚能力的菌株，并對(duì)其降酚特性進(jìn)行了初步的研究。在今后的工作中，應(yīng)進(jìn)一步研究其與好氧工藝配合的降解能力，達(dá)到降解有毒底物所用時(shí)間較短；進(jìn)一步研究菌株降解底物特性，并從生化機(jī)理上進(jìn)行深入研究；通過各種育種手段提高菌的降解能力，如進(jìn)行構(gòu)造基因工程菌，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝，誘變育種，進(jìn)而將其應(yīng)用到工廠、焦化廠等污水處理方面，降低含苯酚的廢水排出，達(dá)到改善環(huán)境的目。

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（責(zé)編：張宏民）