甄靜榮，叢建森，曲江勇，侯建海，郭承華*（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

金氏真蛇尾多糖的抗氧化和抑菌活性研究

甄靜榮，叢建森，曲江勇，侯建海，郭承華*
（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

以黃海產(chǎn)金氏真蛇尾為原材料，采用堿提法，經(jīng)脫脂、脫蛋白后得金氏真蛇尾多糖，通過Fenton反應(yīng)和鄰苯三酚自氧化法來測定多糖溶液對(duì)自由基的清除能力，采用濾紙片法測定金氏真蛇尾多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母菌和灰綠青霉的抑制作用。結(jié)果顯示：金氏真蛇尾多糖對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子（O2-·）具有較好的清除作用，并且清除率與多糖溶液呈現(xiàn)量效關(guān)系，多糖對(duì)羥基自由基（·OH）和超氧陰離子（O2-·）的最大清除率分別為45.68%和40.47%，表明蛇尾多糖具有一定的抗氧化活性，但是仍小于同質(zhì)量濃度的VC溶液；金氏真蛇尾多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和啤酒酵母的抑菌圈大小分別為13.46 mm、14.12 mm和14.73 mm，具有較好的抑菌作用，但對(duì)灰綠青霉則沒有抑制作用。通過抗氧化和抑菌活性的研究，表明黃海產(chǎn)金氏真蛇尾多糖具有較好的抗氧化及抑菌活性。

金氏真蛇尾；多糖；抗氧化活性；抑菌活性

金氏真蛇尾（Ophiura kinbergi）屬棘皮動(dòng)物門（Echino dermata）蛇尾綱（Ophiuroidea）鱗蛇尾科（Ophiolepididae）［1-2］，是分布在黃渤海海域比較常見的一種棘皮動(dòng)物。金氏真蛇尾不僅營養(yǎng)成分含量豐富［3］，而且含有多糖等多種具有生理活性的成分。多糖作為一種重要的生物活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗心血管疾病及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［4-5］，因此金氏真蛇尾的應(yīng)用前景十分廣闊。

在棘皮動(dòng)物中，相比較而言，對(duì)海參綱和海星綱動(dòng)物［6-7］研究較多，而對(duì)蛇尾綱動(dòng)物研究則較少，對(duì)其研究也主要集中在生態(tài)學(xué)分布和再生機(jī)制［8-9］方面。CHEKAREVA V等［10］從Ophiocoma echinata和環(huán)棘鞭蛇尾（Ophiomastix annulosa）兩種動(dòng)物體內(nèi)得到了神經(jīng)節(jié)苷脂。通過質(zhì)譜分析和13C-核磁共振光譜儀等化學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)。從環(huán)棘鞭蛇尾體內(nèi)提取分離并鑒定其結(jié)構(gòu)為雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂。LEVINA V等［11-12］從蛇尾綱中薩氏真蛇尾（Ophiurasarsii vadicola）和Ophiura leptoctenia中分離并鑒定出硫酸化和非硫酸化的兩種甾體化合物；同時(shí)又從薩氏真蛇尾乙醇浸提液中分離并鑒定出聚羥基類固醇硫酸鹽。另外，林翠梧等［13］從采自于廣西潿洲島的錐疣星蔓蛇尾（Axtroclarusconiferus）分離得到4種甾類化合物，利用波譜方法確定出它們的結(jié)構(gòu)，其中一種具有抗腫瘤活性；郭承華等［14］采用甲醇提取法對(duì)分布在黃海海域的金氏真蛇尾皂苷進(jìn)行了提取制備及理化特性的初步研究，首次將其命名為蛇尾皂苷（ophiurasaponin）。甄靜榮等［15］對(duì)金氏真蛇尾皂苷的抗氧化和抑菌活性已有研究。

本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)產(chǎn)自黃海的金氏真蛇尾多糖的抗氧化（對(duì)自由基清除能力的測定）和抑菌（對(duì)不同菌種的抑菌圈直徑和最低抑菌濃度的測定）活性進(jìn)行研究，對(duì)其在功能性食品和保健品行業(yè)的應(yīng)用提供技術(shù)支持，以期為蛇尾綱動(dòng)物資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金氏真蛇尾（Ophiura kinbergi）：2012年5月采于煙臺(tái)崆峒島，洗凈晾干，粉碎備用；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiaeHansen）和青霉（Penicillium glaucum）：本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

三羥甲基氨基甲烷、三氯甲烷、正丁醇、鄰菲啰啉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、抗壞血酸、焦性沒食子酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Buchi R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；20PR-520型冰凍離心機(jī)：日本Hitachi Koki有限公司；T6新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1蛇尾多糖的提取

稱取一定量已粉碎的金氏真蛇尾干燥粉末，用等量丙酮浸泡8 h，棄掉上清液，此步驟重復(fù)3次，收集殘?jiān)髮⑵湔婵崭稍?；把脫脂處理后的金氏真蛇尾粉末?.1 mol/L的NaOH溶液浸泡提取3次，料液比為1∶20（g∶mL），將3次濾液合并，并對(duì)其減壓濃縮；隨后用1 mol/L的HCl將濃縮液的pH調(diào)整為7.0，向其中加入適量的中性蛋白酶，于50℃水浴鍋中加熱攪拌2 h；將溶液進(jìn)行離心，取上清液并將其濃縮。參照Sevag法［16］對(duì)上述多糖溶液進(jìn)行脫蛋白處理，使用截留分子質(zhì)量為3 000 u的透析袋對(duì)多糖溶液進(jìn)行透析；加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液于多糖溶液中進(jìn)行醇沉，靜置后重復(fù)離心，直到無沉淀為止，所得沉淀物即為金氏真蛇尾多糖，將其干燥至恒質(zhì)量備用［17］。

1.3.2蛇尾多糖的理化性質(zhì)測定

采用硫酸-苯酚法，參照文獻(xiàn)［18-19］的方法測定金氏真蛇尾多糖含量，利用濃鹽酸-BaCl2沉淀法鑒定是否含有硫酸根基團(tuán)，并進(jìn)行Molish反應(yīng)鑒定蛇尾多糖是否含有單糖及碘-碘化鉀反應(yīng)鑒定蛇尾多糖是否為非淀粉多糖。

1.3.3蛇尾多糖的抗氧化活性測定

（1）還原力的測定

配制質(zhì)量濃度為0.02 g/mL的堿提多糖溶液，參照LEE S C等［20］的方法測定多糖溶液的還原能力，波長700 nm處測定吸光度值A(chǔ)，陽性對(duì)照用質(zhì)量濃度為0.02 g/mL的維生素C（vitamin C，VC）溶液，空白對(duì)照用蒸餾水代替多糖溶液。所測還原力以吸光度值A(chǔ)700nm表示。

（2）對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

取1 mL質(zhì)量濃度梯度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的多糖溶液，采用Fenton反應(yīng)［21］，在波長536 nm處測定多糖樣品溶液吸光度值A(chǔ)3，空白吸光度值為A1，空白對(duì)照吸光度值為A2，樣品對(duì)照吸光度值為A4，空白參比吸光度值為A0，以VC溶液作為陽性對(duì)照。各試劑的添加順序及添加量具體參見表1。

表1　蛇尾多糖對(duì)·OH清除作用反應(yīng)體系Table 1 Reaction system of the scavenging of theOphiura kinbergi polysaccharide on·OHmL

（3）對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法［22］，測定質(zhì)量濃度為0.5mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的多糖溶液對(duì)O2-·的清除作用，在波長325 nm處測定多糖樣品溶液吸光度值A(chǔ)1，樣品空白吸光度值為A2，模型對(duì)照吸光度值為A3，陽性對(duì)照為VC。各試劑添加順序不能改變，具體添加順序及添加量見表2。

表2　蛇尾多糖對(duì)O2-·清除作用反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of the scavenging of theOphiura kinbergi polysaccharide on O2-·mL

1.3.4蛇尾多糖的抑菌活性測定

（1）菌懸液的制備

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h）和酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)真菌，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，其中青霉培養(yǎng)72 h）。將供試菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將活化的原菌種全部溶解到10 mL無菌生理鹽水中，混勻。另取6支盛有9 mL無菌生理鹽水的試管，取1 mL已溶解的原菌種溶于9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分打散，依此類推，分別配制成濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6CFU/mL的菌懸液，備用。

（2）抑菌圈大小的測定

采用濾紙片法［23］，濾紙片直徑d為6 mm，取0.3 mL濃度為10-6CFU/mL的菌懸液于盛有培養(yǎng)基的平板中，涂勻，取0.5 mL用無菌水配制的質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的多糖溶液，用氯霉素為細(xì)菌的陽性對(duì)照試驗(yàn)，硝酸咪唑康為真菌的陽性對(duì)照，陰性對(duì)照均為無菌生理鹽水；測定蛇尾多糖對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和青霉（Penicillium glaucum）的抑制圈直徑，重復(fù)3次取平均值。

（3）最低抑菌濃度的測定

采用平板劃線法測定最低抑菌濃度（minimalinhibitory concentration，MIC）。分別吸取0.5 mL質(zhì)量濃度為4.000 mg/mL、2.000 mg/mL、1.000 mg/mL、0.500 mg/mL、0.250 mg/mL、0.125 mg/mL的蛇尾多糖溶液加入已滅菌的培養(yǎng)皿中，然后倒入培養(yǎng)基。采用劃線接種法，培養(yǎng)供試的細(xì)菌和真菌，置于恒溫培養(yǎng)箱中，觀察是否有菌落生長；陰性對(duì)照為無菌生理鹽水。無菌落生長的培養(yǎng)皿為金氏真蛇尾多糖的最低抑菌濃度（MIC），重復(fù)3次取平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1蛇尾多糖理化性質(zhì)測定結(jié)果

以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.445 5x+0.004 7（相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7），多糖含量為3.18%；硫酸基團(tuán)鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多糖中含有硫酸根；Molish反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明多糖中含有單糖；碘-碘化鉀反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明多糖為非淀粉多糖。

2.2蛇尾多糖抗氧化活性測定結(jié)果

2.2.1還原力的測定

抗氧化活性與總還原力之間關(guān)系密切，實(shí)驗(yàn)中具有強(qiáng)還原力的樣品可以將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+參與自由基反應(yīng)生成穩(wěn)定物質(zhì)，由此導(dǎo)致體系吸光度值增加。實(shí)驗(yàn)中金氏真蛇尾多糖可以將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀和鐵離子反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，從而中斷自氧化連鎖反應(yīng)，使體系吸光度值增加。實(shí)驗(yàn)測得空白對(duì)照的A700nm值為0.257，金氏真蛇尾多糖的A700nm值為1.145，VC的A700nm值為1.302，證明金氏真蛇尾多糖具有一定的還原力。

2.2.2對(duì)·OH的清除作用

圖1 蛇尾多糖和VC對(duì)·OH的清除作用Fig. 1 Scavenging effects of the Ophiura kinbergi polysaccharide and VC on·OH

由圖1可知，在0～4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，·OH的清除率有明顯上升趨勢；在多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL，達(dá)到最大清除率為45.68%；多糖質(zhì)量濃度＞4 mg/mL以后，·OH的清除率趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，多糖具有一定的·OH的清除作用，但是仍小于同質(zhì)量濃度抗壞血酸溶液。

2.2.3對(duì)O2-·的清除作用

圖2　蛇尾多糖和VC對(duì)O2-·的清除作用Fig.2 Scavenging effects of theOphiura kinbergipolysaccharide and VC on O2-·

由圖2可知，在0～5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，O2-·清除作用也逐漸增強(qiáng)；在多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL，達(dá)到O2-·最大清除率為40.47%；多糖質(zhì)量濃度＞5 mg/mL以后，O2-·清除率趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，多糖O2-·具有一定的清除作用，但是仍小于同質(zhì)量濃度VC溶液。

2.3蛇尾多糖抑菌活性測定結(jié)果

2.3.1抑菌圈大小測定

表3　蛇尾多糖的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of bacteriostatic circle of theOphiura kinbergi polysaccharidemm

由表3可知，金氏真蛇尾多糖對(duì)其中3種受試菌株具有較好的抑菌作用，其中對(duì)啤酒酵母菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性最強(qiáng)，其抑菌圈直徑分別是14.73 mm、14.12 mm，大腸桿菌次之為13.46 mm，而對(duì)青霉則沒有抑制作用。

2.3.2最低抑菌濃度測定

表4　蛇尾多糖最低抑菌濃度Table 4 The minimum inhibitory concentration of theOphiura kinbergi polysaccharides

由表4可知，金氏真蛇尾多糖對(duì)金黃色葡萄球菌和啤酒酵母菌的MIC值均為1.0 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC稍高為2.0 mg/mL，而對(duì)青霉無抑制作用。青霉與另外3種菌相比，適應(yīng)性與生命力比較強(qiáng)，因此多糖對(duì)其抑制作用比較弱。

3　結(jié)論

通過對(duì)黃海產(chǎn)金氏真蛇尾多糖的抗氧化和抑菌活性的研究，可以看出金氏真蛇尾多糖對(duì)·OH和O2-·具有清除作用，且隨著多糖質(zhì)量濃度的升高而增加，在達(dá)到一定濃度以后，清除率便會(huì)趨于穩(wěn)定，其最大清除率分別為45.68%和40.47%，但是仍小于同質(zhì)量濃度的VC溶液，說明蛇尾多糖具有較好的抗氧化活性；同時(shí)金氏真蛇尾多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和啤酒酵母菌的抑菌圈大小分別為13.46 mm、14.12 mm、14.73 mm，最低抑菌濃度分別為2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、1.0 mg/mL，而對(duì)青霉則沒有抑制作用。

目前，人們對(duì)蛇尾綱動(dòng)物的活性成分研究尚剛起步，但蛇尾綱動(dòng)物作為海洋底棲生物的重要組成部分，其在海洋生態(tài)系統(tǒng)、海洋功能食品、生物醫(yī)藥等方面具有重要及深遠(yuǎn)意義。隨著研究的不斷開展與深入，蛇尾綱動(dòng)物資源的保護(hù)與利用亦將顯示出更廣闊的應(yīng)用前景。

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Research on antioxidant and antibacterial activity of polysaccharide inOphiura kinbergi

ZHEN Jingrong，CONG Jiansen，QU Jiangyong，HOU Jianhai，GUO Chenghua*
（College of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，China）

WithOphiura kinbergiin Huanghai Sea as raw materials，after degreasing and deproteinization，the polysaccharide inO.kinbergi was obtained by alkali extraction method.The capacity of scavenging free radicals of polysaccharide solution was measured by Fenton reaction and pyrogallol autoxidation method.The inhibiting effect ofO.kinbergipolysaccharide onEscherichia coli，Staphylococcus aureus，Saccharomyces cerevisiae Hansen andPenicillium glaucumwas measured by filtering paper method.The results showed that theO.kinbergipolysaccharide had good scavenging effect on hydroxyl radical（·OH）and superoxide anion radical（O2·-），and the clearance rate showed dose-effect relationship with polysaccharide solution.The maximum clearance rates of·OH and O2·-of polysaccharide were 45.68%and 40.47%，respectively，which showed that theO.kinbergi polysaccharide had a certain antibacterial activity，but it was less than the antibacterial activity of VC in the same concentration.TheO.kinbergi polysaccharide had good antibacterial activity onE.coli，S.aureusandS.cerevisiaeHansen.The diameters of antibacterial circle were 13.46 mm，14.12 mm and 14.73 mm，but it had no antibacterial activity onP.glaucum.The study indicated theO.kinbergipolysaccharide had good antioxidant effect and antibacterial activity.

Ophiura kinbergi；polysaccharide；antioxidant activity；antibacterial activity

Q539.7

A

0254-5071（2015）11-0136-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.031