張　鑫，趙　勇，譚海東，馬君燕，3，李悝悝，張建平，尹恒*（.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連6023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京00049；3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連6622）

稻瘟病菌單加氧酶lpmo M1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

張?chǎng)?，2，趙勇1，譚海東1，馬君燕1，3，李悝悝1，張建平1，尹恒1*
（1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連116023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116622）

多糖裂解單加氧酶（LPMO）是一類新型的可以與水解酶系協(xié)同降解纖維素、幾丁質(zhì)和淀粉等難溶多糖的酶。以稻瘟病菌（Magnaporthe grisea70-15）為研究對(duì)象，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)克隆得到多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPICZαA-lpmo M1。生物信息學(xué)分析表明該基因編碼區(qū)長(zhǎng)819 bp，編碼272個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)該基因的理論分子質(zhì)量為28.85 ku，等電點(diǎn)為7.66；結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示存在7個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)。通過(guò)生物軟件Vector NTI對(duì)不同來(lái)源的LPMO的同源性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示稻瘟病菌LPMO M1與其他LPMO同源性最高僅為41%；系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌（Magnaporthe grisea70-15）的多糖裂解單加氧酶LPMO M1與黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的同類酶Gh61D親緣關(guān)系最近。

纖維素；多糖裂解單加氧酶；稻瘟病菌；真核表達(dá)載體；生物信息學(xué)分析

隨著能源需求的增長(zhǎng)、儲(chǔ)備的減少以及全球溫室效應(yīng)的加劇，尋求可替代化石燃料的可再生能源已亟不可待［1］。除太陽(yáng)能和風(fēng)能等潔凈能源外，含量豐富的生物質(zhì)能源成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)［2］。木質(zhì)纖維素是自然界中分布極其廣泛且數(shù)量極多的生物質(zhì)資源，全球每年纖維素的產(chǎn)量約為8×1013kg［3-4］，合理地利用這類資源將會(huì)對(duì)能源危機(jī)的緩解具有重大意義［5-6］。目前高效、環(huán)保的利用纖維素等難溶多糖是該類生物質(zhì)開發(fā)和利用的一大瓶頸，纖維素的利用主要通過(guò)化學(xué)法和酶法，與化學(xué)法相比，酶法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。酶法主要是通過(guò)由內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-1，4-D-葡萄糖苷酶組成的酶系降解纖維素。由于傳統(tǒng)的纖維素酶系均屬于糖苷水解酶家族，它們對(duì)于底物結(jié)晶區(qū)的降解效率較低，且成本較高，這使得傳統(tǒng)的纖維素酶系難以滿足工業(yè)應(yīng)用的需求，限制了纖維素等生物質(zhì)的高效利用［7-9］。

2010年VAAJE-KOLSTAD G團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一個(gè)可以破壞幾丁質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的酶，它主要通過(guò)氧化作用破壞糖苷鍵，為幾丁質(zhì)酶的進(jìn)一步作用奠定了基礎(chǔ)，最終得到可溶性寡糖或單糖［10-11］。該酶即為多糖裂解單加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenases，LPMO），是一類在二價(jià)金屬離子和還原劑存在的條件下氧化破壞難溶多糖晶體結(jié)構(gòu)的酶。它的出現(xiàn)提高了難溶多糖的降解效率，使得生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化成為可能。LPMO的分類原則有3種，根據(jù)氨基酸序列可以分為AA9家族、AA10家族和AA11家族；根據(jù)作用底物可以分為以纖維素為底物的LPMO、以幾丁質(zhì)為底物的LPMO和以淀粉為底物的LPMO［12］；根據(jù)作用機(jī)制可以分為PMO1、PMO2和PMO3［13］。近年來(lái)，科學(xué)家們對(duì)LPMO展開了深入地研究，但是仍然有很多尚待解決的問(wèn)題，所以尋找新的酶源對(duì)LPMO后續(xù)的研究和早日實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化有重要意義。

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea70-15）是水稻的一種常見致病菌，研究表明該菌的致病性可能與其分泌的纖維素酶和果膠酶可以破壞水稻的細(xì)胞壁有關(guān)［14］。該菌株的基因組全序列已經(jīng)測(cè)序完成，根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Magnaporthe grisea70-15有24個(gè)AA9家族基因，這為新型酶源的獲得提供了可能。該文為研究稻瘟病菌中LPMO的性質(zhì)與功能，以LPMO M1為研究對(duì)象，成功構(gòu)建了酵母表達(dá)載體，并且對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)方面的分析，為后續(xù)研究LPMO的功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株和載體

大腸桿菌（EscherichiacoliTop10）、畢赤酵母X-33（Pichia pastorisX-33）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea70-15）：西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所；克隆載體pEASY-BluntZero Cloning Vector：大連萬(wàn)澤有限公司；表達(dá)載體pPICZαA：美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，固體培養(yǎng)時(shí)加入2%瓊脂，用于轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)加入100μg/mL氨芐青霉素。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%。

1.1.3酶和試劑

1.2儀器與設(shè)備

ML 104/02電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；QHZ-98A全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；精科752型紫外分光光度計(jì)；Gene Pulser XcellTM電穿孔系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1的克隆

將稻瘟病菌（Magnaporthe grisea70-15）接種在PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d后使用真菌RNA提取試劑盒提取稻瘟病菌RNA、寶生物工程（大連）有限公司的cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。根據(jù)GeneBank中公布的稻瘟病菌的LPMO M1基因序列（登錄號(hào)：XM_003709062.1）和酵母表達(dá)載體pPICZαA設(shè)計(jì)引物，為了保證得到含有天然N端的LPMO M1，設(shè)計(jì)引物時(shí)去除LPMO M1的信號(hào)肽序列，上游引物5′-GACCTCGAGAAAAGACACTACAACTTCGAGT CCCTC-3′，下游引物：5′-CTTGCGGCCGCGTAGTGTGCG GAGCGGCG-3′［15］，下劃線標(biāo)記的序列為酶切位點(diǎn)，分別為XhoI和NotI，粗體部分為載體kex2信號(hào)酶裂解位點(diǎn)。以稻瘟病菌Magnaporthe grisea70-15cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因的編碼區(qū)，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系（50 μL）：ddH2O 34.3 μL，5×buffer 10 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）4μL，上游引物（100μmol/L）0.1μL，下游引物（100μmol/L）0.1 μL，PrimeSTARRHS DNA Polymerase 0.5 μL，真菌模板基因組DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒回收，然后與克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning vector連接，轉(zhuǎn)入E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，在LB/Amp平板上篩選陽(yáng)性克隆。菌落PCR檢測(cè)是否有插入片段，挑取單菌落，在LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，用XhoI和NotI進(jìn)行雙酶切鑒定，送華大基因（北京）測(cè)序，采用Vector NTI軟件分析測(cè)序結(jié)果。

1.3.2稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1的表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)化

將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆37℃過(guò)夜培養(yǎng)，菌液經(jīng)質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒后，用XhoI和NotI在37℃雙酶切2 h后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收酶切后的目的片段，再與經(jīng)過(guò)相同雙酶切的pPICZαA酵母表達(dá)載體用T4DNA連接酶室溫連接20 h。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR和雙酶切鑒定酵母表達(dá)載體是否構(gòu)建成功，并送至華大基因（北京）測(cè)序，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pPICZαA-lpmo M1。

將測(cè)序正確的質(zhì)粒pPICZαA-lpmoM1用限制性內(nèi)切酶SacI線性化，然后轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞，并對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，以檢測(cè)該表達(dá)載體是否轉(zhuǎn)入畢赤酵母中。1.3.3多糖裂解單加氧酶基因及其編碼蛋白生物信息學(xué)分析

通過(guò)生物在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)LPMO M1的分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點(diǎn)等；根據(jù)SignalP對(duì)該蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；在NCBI網(wǎng)站對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；采用生物在線網(wǎng)站NetNGlyc 1.0 Server和NetOGlyc 3.1 Serve對(duì)該蛋白中存在的N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)；利用NetPhos 2.0 Server預(yù)測(cè)其磷酸化位點(diǎn)［16-17］。通過(guò)生物學(xué)軟件Vector NTI分析多糖裂解單加氧酶的序列同源性，并通過(guò)MEGA 6.0軟件的ML法分析AA9家族LPMO的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系［18］。

2　結(jié)果與分析

2.1稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1的克隆

以Magnaporthe grisea70-15 cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，在750～1 000 bp之間有清晰的條帶，大小與預(yù)測(cè)一致。將其連接至克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning Vector中，雙酶切結(jié)果表明，酶切后的片段與目的片段大小一致，結(jié)果見圖2。測(cè)序后與稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶lpmo M1基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明有1個(gè)堿基發(fā)生同義突變，說(shuō)明獲得的基因編碼區(qū)序列是正確的，可以構(gòu)建表達(dá)載體。

圖1　多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)Fig.1 Agarose gel analysis of PCR amplification products of lpmo M1gene

圖2　lpmo M1基因重組質(zhì)粒pEASY-lpmo M1的雙酶切鑒定Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid pEASY-lpmo M1of lpmo M1

2.2稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1表達(dá)載體的構(gòu)建

將目的片段與用相同酶切回收后的表達(dá)載體pPICZαA連接，電擊（電壓2000V，電容25μF，電阻200Ω）轉(zhuǎn)入E.coli Top10，挑取陽(yáng)性克隆采用菌落PCR和雙酶切方法鑒定重組表達(dá)載體。通過(guò)PCR鑒定，所用引物為檢測(cè)引物，目的片段大小為1 000 bp左右（圖3）；另外通過(guò)雙酶切鑒定顯示重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)XhoI和NotI雙酶切，得到大小分別為3 593 bp和819 bp的條帶（圖4），與預(yù)期估計(jì)條帶大小相符。將構(gòu)建好的載體送華大基因測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果與克隆序列一致，開放閱讀框架正確。結(jié)果表明稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1酵母表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3　稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因重組質(zhì)粒pPICZαA-lpmo M1菌落PCR鑒定Fig.3 Colony PCR identification of recombinant plasmid pPICZαA-lpmo M1ofMagnaporthe griseaLPMO

圖4　稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因重組質(zhì)粒pPICZαA-lpmo M1雙酶切鑒定Fig.4 Double digestion of recombinant plasmid pPICZαA-lpmo M1of Magnaporthe griseaLPMO

2.3稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶基因lpmo M1的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33

圖5　畢赤酵母轉(zhuǎn)化子菌落PCR鑒定Fig.5 PCR identification ofPichia pastoristransformant

將構(gòu)建好的酵母表達(dá)載體pPICZαA-lpmoM1通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，在含有博來(lái)霉素和山梨醇的酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小為1500bp和2200bp的條帶（圖5），結(jié)果表明酵母表達(dá)載體pPICZαA-lpmo M1成功導(dǎo)入畢赤酵母X-33中，可用于下一步多糖裂解單加氧酶的表達(dá)、純化以及活性研究。

2.4稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶LPMO M1的生物信息學(xué)分析

2.4.1稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶lpmo M1基因及其編碼氨基酸序列分析

對(duì)多糖裂解單加氧酶lpmo M1基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因序列長(zhǎng)度為819bp，編碼272個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為28.85ku，等電點(diǎn)為7.66，分子式為C1285H1956N350O391S7，原子總數(shù)為3 989，總平均親水性為-0.322，說(shuō)明lpmo M1親水性較強(qiáng)。在NCBI網(wǎng)站對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析表明，該多糖裂解單加氧酶只有1個(gè)結(jié)構(gòu)域（AA9）。通過(guò)SignalP軟件分析得知LPMO M1的信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于21位的A（丙氨酸）。通過(guò)在線分析軟件NetNGlyc1.0和YinOYang1.2對(duì)多糖裂解單加氧酶LPMO M1進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該氨基酸序列沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)；分別在184、208、211、217、226、227和248位存在7個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)。用NetPhos 2.0在線分析軟件對(duì)其磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)閾值為0.5時(shí)，其氨基酸序列存在16個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)（9個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、5個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)）。

2.4.2不同真菌來(lái)源的多糖裂解單加氧酶的同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖6　LPMO M1與AA9家族LPMO的氨基酸序列比對(duì)Fig.6 The amino acid sequence comparison of LPMO M1 and other LPMOs in AA9 family

利用Vector NTI將LPMO M1的氨基酸序列與不同真菌來(lái)源的多糖裂解單加氧酶的氨基酸序列比對(duì)［10］，分析顯示上述LPMO來(lái)源于不同的種屬，由于種屬間的差異性導(dǎo)致其同源性較低（圖6）。稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶LPMO M1與Gh61D、Gh61E、LPMO9D、Gh61B和Cel61A的同源性分別為41%、36%、36%、27%和22%。這些酶均屬于AA9家族，該家族酶的活性位點(diǎn)是由2個(gè)組氨酸和1個(gè)酪氨酸構(gòu)成的銅離子結(jié)合位點(diǎn)（圖6中用*標(biāo)注），這3個(gè)氨基酸在該類酶中是高度保守的［19］。利用MEGA 6.0對(duì)15個(gè)不同來(lái)源的LPMO進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，從稻瘟病菌LPMO M1與其他真菌來(lái)源LPMO的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出（圖7），不同來(lái)源的LPMO根據(jù)氧化位點(diǎn)的不同形成2個(gè)明顯的分支，其中Ⅰ號(hào)分支由氧化C-1位的PMO1和氧化C-4位的PMO2組成，Ⅱ號(hào)分支由氧化C-1位和C-4位的PMO3組成［13］。稻瘟病菌（Magnaporthe grisea70-15）多糖裂解單加氧酶LPMO M1位于Ⅰ號(hào)分支，屬于PMO1家族，與黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的Gh61D親緣關(guān)系最近［20］。

圖7　稻瘟病菌LPMO M1與其他真菌來(lái)源LPMO的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 The phylogenetic tree analysis of LPMO M1 fromMagnaporthe griseawith other fungus

3　結(jié)論

纖維素雖然是自然界中含量最豐富的生物質(zhì)資源，但是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和難以降解的特性大大限制了纖維素等生物質(zhì)的高效利用。多糖裂解單加氧酶是最新發(fā)現(xiàn)的可以氧化降解結(jié)晶多糖的一類酶，這為闡明自然界中生物質(zhì)的降解機(jī)制提供了新的視角［10］，并且為提高生物質(zhì)的降解效率，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

采用RT-PCR擴(kuò)增得到稻瘟病菌中的一個(gè)多糖裂解單加氧酶基因序列，并且成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA-lpmo M1，其攜帶的基因在宿主中可以穩(wěn)定遺傳。利用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)稻瘟病菌多糖裂解單加氧酶LPMO M1的基因序列和氨基酸序列進(jìn)行分析；通過(guò)Vector NTI生物分析軟件對(duì)不同真菌來(lái)源的LPMO的氨基酸序列的同源性進(jìn)行分析，結(jié)果表明該酶與其他同類酶同源性較低。PMO與來(lái)源于Phanerochaete chrysosporium的LPMO（Gh61D）的親緣關(guān)系最近，該基因在畢赤酵母X-33中的表達(dá)量較低，后續(xù)將通過(guò)密碼子優(yōu)化、表達(dá)條件優(yōu)化以及篩選高拷貝的轉(zhuǎn)化子等方法提高表達(dá)量，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。稻瘟病菌中含有豐富的LPMO，深入地研究每個(gè)多糖裂解單加氧酶的性質(zhì)對(duì)于早日闡明稻瘟病菌降解纖維素的機(jī)制和提高纖維素的降解效率具有重要意義。

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Cloning and bioinformatic analysis oflpmo M1fromMagnaporthe oryzae

ZHANG Xin1，2，ZHAO Yong1，TAN Haidong1，MA Junyan1，3，LI Kuikui1，ZHANG Jianping1，YIN Heng1*
（1.Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.Medical College of Dalian University，Dalian 116622，China）

Lytic polysaccharide monooxygenases（LPMO）is a new type of enzymes that acts synergistically with hydrolase system to degrade recalcitrant polysaccharide，such as cellulose，chitin and starch.In order to study the function of LPMO fromMagnaporthe grisea70-15，lpmo M1was cloned by RT-PCR and its eukaryotic expression vector pPICZαA-lpmo M1was constructed.Bioinformatic analysis showed that the coding region of lpmo M1was 819 bp，which encoded 272 amino acids，and the theory molecule weight was predicted as 28.85 ku and the soelectric point was 7.66. The structure predicted that it had 7 O-glycosylation sites and 16 phosphorylation sites，but no N-glycosylation sites.Homologous analysis by Vector NTI software indicated that LPMO M1 had a low homology with other LPMOs of the different organisms.The phylgenetic analysis results showed that LPMO M1 had a most close phylogenetic relationship with the LPMO fromPhanerochaete chrysosporium.

cellulose；lytic polysaccharide monooxygenases；Magnaporthe grisea；eukaryotic expression vector；bioinformatic analysis

Q933

A

0254-5071（2015）11-0035-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.009

2015-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（31370811）；遼寧省自然科學(xué)基金（2015020690）；中科院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)（2015144）

張?chǎng)危?990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)利用。

尹恒（1982-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與糖工程。