徐　靜，顧晨艷，吳小晶，鄧連婷，溫洪宇*（江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州221116）

腌制牛蒡鹽鹵中嗜鹽菌群組成的研究

徐靜，顧晨艷，吳小晶，鄧連婷，溫洪宇*
（江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州221116）

為了研究腌制牛蒡鹽鹵中嗜鹽菌群物種組成，采用微生物學方法對腌制牛蒡鹽鹵進行多次逐級梯度稀釋后涂布，最后通過劃線純化菌株；通過革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)；經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測，獲得16S rRNA基因序列，進而進行序列比對分析，對菌株進行分子生物學鑒定。結(jié)果表明，從腌制牛蒡鹽鹵中篩選分離獲得2株嗜鹽細菌菌株，編號為X1和X2，其中X1菌株與腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）模式菌株的16S rRNA基因序列相似度為99.81%；X2菌株與人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）模式菌株的16S rRNA基因序列相似度為100%。腌制牛蒡鹽鹵中的優(yōu)勢菌株為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）。

牛蒡；嗜鹽菌；聚合酶鏈反應(yīng)；系統(tǒng)發(fā)育樹；菌群組成

牛蒡（Arctium lappaL.）為菊科草本類植物，其化學成分豐富，具很高的食用、藥用和營養(yǎng)價值［1］。牛蒡有明顯的降血糖、防治糖尿病腎病、抗病毒、抗腫瘤活性、鎮(zhèn)咳作用及促有絲分裂、肝保護作用等［2］。低鹽條件下腌制牛蒡，可以改善其品質(zhì)、安全性和營養(yǎng)價值。腌制牛蒡的鹽鹵作為一種特殊的高鹽環(huán)境，分布了多種嗜鹽菌，分離鑒定這些嗜鹽菌，對腌制牛蒡中微生物類群分析和食品安全的研究至關(guān)重要。

近年來，嗜鹽菌由于其獨特的生理生化特性而被學者廣泛研究，大都以鹽場、鹽湖、海洋等地對嗜鹽菌進行鑒定分析，腌制食品的鹽鹵是一種重要的鹽生環(huán)境，分布了多種嗜鹽菌。張琦等［3］對腌制鹽鹵進行了研究。嗜鹽菌是一類生活在高鹽度環(huán)境中的微生物，通常生長在鹽湖、鹽堿地、海水以及鹽制品等高鹽環(huán)境中［4］。分子生物學的發(fā)展，以16S rRNA序列分析為主的多相分類在嗜鹽菌分類學的研究上起了重要作用［5］。由于嗜鹽菌具有獨特的結(jié)構(gòu)組成、生理機能和遺傳基因，很多研究者對其在酶工業(yè)、生物電子學、環(huán)境生物學、醫(yī)藥工業(yè)、能源開發(fā)等領(lǐng)域開展了應(yīng)用研究［6］，嗜鹽菌的潛在價值一直是人們關(guān)注的焦點。該文對腌制牛蒡鹽鹵中的嗜鹽菌進行分離，研究菌落與菌體形態(tài)特征、16S rRNA基因序列、系統(tǒng)發(fā)育分析以及其分子生物學地位，確定腌制牛蒡鹽鹵中的嗜鹽菌群的組成，為腌制食品中嗜鹽菌的多樣性及食品安全問題提供參考，為腌制牛蒡的風味和品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)，有利于系統(tǒng)地調(diào)查嗜鹽菌的菌種資源和豐富嗜鹽菌的分類［7］，在腌制牛蒡的過程中可以提供食品安全指導(dǎo)，為保障食用者的安全做出貢獻。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品采集

無菌操作采集某榨菜廠牛蒡榨菜腌制早期鹽鹵樣品，于4℃冰箱保存。

1.1.2培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨7.5 g，檸檬三鈉3 g，氯化鈉100 g，氯化鉀2 g，硫酸鎂10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌25 min后備用。

1.1.3化學試劑

溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、草酸銨結(jié)晶紫、碘液、體積分數(shù)95%乙醇、番紅：上海歌凡生科公司；上下游引物、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生工生物工程；PCR Master Mix、Loading Buffer、DNA Marker：大連寶生物制品有限公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

TC-25/HPCR擴增儀：杭州博日科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；TGL-16B型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-C臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；DHP-905 2型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌株的分離純化

采用逐級梯度稀釋方法，將鹵水稀釋液均勻涂布于含10%NaCl的平板上，37℃培養(yǎng)48 h后，挑取典型單菌落，繼續(xù)采用逐級梯度稀釋法涂布于平板，重復(fù)多次后，挑取單一菌落，革蘭氏染色后，鏡檢觀察細胞形態(tài)與著色是否均一。最后采用平板劃線法，繼續(xù)純化傳代3次后，轉(zhuǎn)接于斜面，4℃冰箱保藏、備用。

1.3.2菌落、菌體特征

觀察生長于平板的單菌落，包括形狀、大小、顏色和表面特征等。采用革蘭氏染色法，觀察菌體的形狀、大小與顏色。

1.3.3基因組總DNA的抽提、16S rRNA基因的PCR擴增

采用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌株總DNA。

以菌體總DNA為模版，采用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增16S rRNA基因，16S rRNA基因的PCR擴增體系參照沈露露等［8］的方法。前引物為27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（對應(yīng)于E.coli 16S rRNA基因的8～27個堿基位置），后引物1 492R：5'-CT ACGGTTACCTTGTTACGAC-3'（對應(yīng)于E.coli16S rRNA基因的第1 492～1 510個堿基位置）［9］，對細菌16S rRNA基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：首先，94℃預(yù)變性5 min，然后，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后，72℃延伸10 min。取25 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)采集照片并記錄結(jié)果。

1.3.4 16S rRNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將膠回收后的PCR產(chǎn)物寄到南京思普金生物技術(shù)有限公司進行測序。在對16S rRNA基因序列進行相似性分析的基礎(chǔ)上，采用Clustalx1.83與MEGA4.0等軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其分類學地位。

2　結(jié)果與分析

2.1形態(tài)分析

2.1.1菌落形態(tài)

從鹽鹵中分離純化獲得兩株可在鹽含量為10%的培養(yǎng)基上生長的細菌，編號為X1、X2，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，X1菌落形態(tài)呈黃色、圓形、表面濕潤、隆起、菌落偏小。X2的菌落呈白色、圓形、表面光滑、隆起、菌落中等大小。

圖1　X1、X2菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologies of strain X1 and X2

2.1.2菌體特征

細菌X1、X2經(jīng)過革蘭氏染色，在淮鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，兩株細菌均呈紫色，表明這兩株細菌都是革蘭氏陽性菌。兩株細菌的形態(tài)均為球狀。

圖2　X1、X2菌株革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Results of gram staining of strain X1 and X2

2.2 16S rRNA基因的PCR擴增產(chǎn)物與測序結(jié)果

對16S rRNA基因序列PCR擴增后的產(chǎn)物進行了1%瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis，AGE）、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，X1、X2均有明顯的亮帶，通過與Marker比較，目的片段為1 500 bp左右，表明獲得了目的基因。通過分析測序結(jié)果，將波峰重疊片段去除，選取有效片段，得到兩株細菌的有效序列。

圖3　PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplification products

2.3 16S rRNA基因序列相似度和系統(tǒng)發(fā)育樹

對兩株細菌X1、X2的16S rRNA基因序列進行BLAST分析和比對，然后利用Clustalx1.83與MEGA4.0等軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4　基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the construction of 16S rRNA gene sequences

由圖4可知，研究發(fā)現(xiàn)rRNA結(jié)構(gòu)既具有高變性，又具有保守性。而rRNA的高變性能揭示生物物種的特征核酸序列，可作為屬種鑒定的分子基礎(chǔ)。因為rRNA的保守性能夠反映生物物種之間的的親緣關(guān)系，所以rRNA能為系統(tǒng)發(fā)育樹重建的研究提供可靠依據(jù)［10-11］。其中，16S rRNA及其類似的rRNA基因序列是生物系統(tǒng)發(fā)育研究最為合適的指標［12］。當菌種16S rRNA基因序列的同源性低于93%～95%時，則可初步判斷這兩種菌屬于不同屬；同源性在95%～98%時，則可初步判斷這兩種菌屬于不同種；同源性＞98%時，則可初步判斷這兩種菌屬于同種［13］。

從系統(tǒng)發(fā)育樹上分析來看：X1菌株與腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）聚為一支，所以兩者具有親緣性，而且序列的同源性為99.81%，進而可以認為X1菌株屬于腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。X2菌株與人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）聚為一支，所以兩者具有親緣性，而且序列的同源性為100%，進而可以認為X2菌株屬于人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）。

3　結(jié)論

本研究從腌制牛蒡鹽鹵中分離得到兩株嗜鹽細菌，兩者均為革蘭氏陽性菌且都是葡萄球菌；根據(jù)嗜鹽顯示值范圍（3%～15%）來看兩者屬于中度嗜鹽菌［14］。分離得到的兩株菌經(jīng)16S rRNA基因序列分析后表明，X1菌株與腐生葡萄球菌（Staphylococcussaprophyticus）的序列同源性達到99.81%，X2菌株與人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）的序列同源性為100%。初步認為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）是腌制牛蒡鹽鹵中的優(yōu)勢菌株。

人葡萄球菌為一種少見的條件致病菌［15］，作為大規(guī)模生產(chǎn)腌制牛蒡的食品安全檢測依據(jù)還待進一步深入研究。通過分子生物學方法研究腌制食品中嗜鹽細菌的多樣性，豐富了嗜鹽菌的物種資源，進一步為腌制食品中嗜鹽菌的多樣性做出貢獻，為系統(tǒng)性地進行嗜鹽菌的調(diào)查和分類提供參考。

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Research of halophilic bacteria community in the pickled burdock bittern

XU Jing，GU Chenyan，WU Xiaojing，DENG Lianting，WEN Hongyu*
（College of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China）

Halophilic microflora in pickled burdock bittern was researched by microbiological methods and the strains was gradient diluted repeatedly，and purified by plate streak.Bacteria morphology was observed by gram staining.16S rRNA gene sequence ofhalophilic bacteriawas obtained by polymerase chain reaction.After comparing and analyzing gene sequence，the strain was identified by molecular biology.The results showed that two strains of halophilic bacteria screened and separated from pickled burdock bittern were named as X1 and X2 respectively.Strain X1 was similar to Staphylococcus saprophyticuswith sequence similarity 99.81%，and strain X2 is similar toStaphylococcus hominiswith sequence similarity 100%. The dominant strains in pickled burdock bittern wereS.saprophyticusandS.hominis.

burdock；halophilic bacteria；polymerase chain reaction；phylogenetic tree；microflora

Q93-33

A

0254-5071（2015）11-0119-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.027

2015-10-09

江蘇省大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃（201410320026Z）

徐靜（1992-），女，本科生，研究方向為嗜鹽微生物。

溫洪宇（1973-），男，副教授，博士，研究方向為環(huán)境微生物。