錢巖，于生，單鳴秋，姚衛(wèi)峰，張麗

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

·中藥工業(yè)·

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化宣木瓜藥材、飲片一體化加工工藝△

錢巖，于生，單鳴秋，姚衛(wèi)峰，張麗*

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

目的：建立和優(yōu)化適宜的藥材、飲片一體化加工工藝。方法：以齊墩果酸和熊果酸總量為指標(biāo)，結(jié)合外觀性狀，單因素考察蒸制時間、干燥溫度和干燥時間對宣木瓜飲片的影響，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化一體化加工工藝。結(jié)果：宣木瓜燙5 min后，再繼續(xù)蒸4 min，切薄片，60 ℃干燥5 h為最佳工藝。結(jié)論：該工藝與傳統(tǒng)飲片炮制工藝相比較，在保證飲片質(zhì)量的同時，也降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。

宣木瓜；一體化加工；響應(yīng)面

木瓜是薔薇科植物貼梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai的干燥近成熟果實(shí)。安徽宣城木瓜品質(zhì)優(yōu)良，《本草綱目》記載：木瓜處處有之，而宣城者為佳，故稱宣木瓜。木瓜作為常用中藥，具有舒筋活絡(luò)，和胃化濕的功能[1]。

響應(yīng)面方法(response surface methodology，RSM)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[2-3]。《中華人民共和國藥典》2010版(一部)對木瓜的產(chǎn)地加工和飲片炮制方法分別做了規(guī)定；相關(guān)文獻(xiàn)對宣木瓜產(chǎn)地加工的研究主要集中于熟曬法和生曬法的比較[4-8]，飲片炮制集中于不同炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[9-11]。上述藥材、飲片分別加工的方式雖然有利于長途運(yùn)輸與貯藏，但重復(fù)了干燥等環(huán)節(jié)，整體增大了飲片的生產(chǎn)成本。為減少藥材加工與飲片加工過程中的重復(fù)環(huán)節(jié)，擬以中華人民共和國藥典規(guī)定的熊果酸和齊墩果酸總含量為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)選藥材、飲片加工工藝參數(shù)，建立適宜的宣木瓜藥材、飲片一體化加工方法，形成具有推廣價值的實(shí)用技術(shù)。

1 儀器與試藥

2695型高效液相色譜儀、2998 PDA型紫外檢測器(美國Waters公司)；電子天平(BP211D型，0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；離心機(jī)(Anke TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(HG-9023A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超聲清洗器(KH-500B，額定功率500 W，額定頻率40 Hz，昆山市超聲儀器有限公司)。

宣木瓜鮮品7月采自安徽宣城新田鎮(zhèn)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai的近成熟果實(shí)。齊墩果酸對照品、熊果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110709-201206，110742-201220)；超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng)制備)；甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)；其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent HC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265∶35∶0.1∶0.05)；檢測波長：210 nm；柱溫：18 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每mL含0.111 mg齊墩果酸、0.098 mg熊果酸的混合對照品溶液，即得。

注：A.對照品；B.樣品；1.齊墩果酸；2.熊果酸。圖1 宣木瓜對照品及樣品HPLC圖

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量。超聲處理(功率為500 W，頻率為40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.1.4 水分的測定 取本品粉末，按《中華人民共和國藥典》2010版第一法(烘干法)測得水分。

2.2 數(shù)據(jù)處理

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上優(yōu)選蒸制時間、干燥溫度、干燥時間對本試驗(yàn)有關(guān)鍵影響的3個因素，設(shè)定試驗(yàn)因素與水平，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用3因素3水平共計(jì)17個試驗(yàn)點(diǎn)。以熊果酸、齊墩果酸總含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析進(jìn)行工藝條件的優(yōu)化，并運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到擬合方程，P<0.01，模型擬合極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)P>0.05，實(shí)測值與預(yù)測值之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測性。

3 結(jié)果與分析

3.1 宣木瓜藥材、飲片一體化加工工藝單因素試驗(yàn)

3.1.1 蒸制時間對熊果酸齊墩果酸總量的影響 將宣木瓜鮮品洗凈，置沸水中燙5 min，繼續(xù)蒸0、5、10 min，切片，80 ℃干燥6 h，打粉，過100目篩。按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)HPLC法測定熊果酸和齊墩果酸的總量，平行3份，以考察蒸制時間對宣木瓜中熊果酸和齊墩果酸總含量的影響。結(jié)果表明，在燙5 min后，繼續(xù)蒸0、5、10 min的宣木瓜中分別含0.539%、0.575%、0.511%的齊墩果酸和熊果酸，即蒸5 min的宣木瓜中齊墩果酸和熊果酸的總含量最高。

3.1.2 干燥溫度對熊果酸齊墩果酸總量的影響 將宣木瓜鮮品洗凈，置沸水中燙5 min，繼續(xù)蒸5 min，切片，分別在60、70、80、90 ℃干燥6 h，打粉，過100目篩。按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)HPLC法測定熊果酸和齊墩果酸的總量，平行3份，以考察干燥溫度對宣木瓜中熊果酸和齊墩果酸總含量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)60、70、80、90 ℃干燥相同時間的宣木瓜中分別含0.771%、0.498%、0.456%、0.397%的熊果酸和齊墩果酸，即隨著干燥溫度的增加，宣木瓜中熊果酸和齊墩果酸的總含量逐漸減少。

3.1.3 干燥時間對熊果酸齊墩果酸總量的影響 宣木瓜鮮品洗凈，置沸水中燙5 min，繼續(xù)蒸5 min，切片，分別在60 ℃條件下干燥4、6、8、10、12 h，打粉，過100目篩。按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)HPLC法測定熊果酸和齊墩果酸的總量，平行3份，以考察干燥溫度對宣木瓜中熊果酸和齊墩果酸總含量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)60 ℃干燥4、6、8、10、12 h的宣木瓜中分別含0.577%、0.440%、0.482%、0.428%、0.431%的齊墩果酸和熊果酸，隨著干燥時間的延長，宣木瓜中熊果酸和齊墩果酸的總含量趨于減少。

表1 不同加工方法對宣木瓜外觀性狀的影響

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理，以蒸制時間(A)、干燥溫度(B)、干燥時間(C)3個因素為自變量，每個因素取3個水平，分別以-1、0、1編碼，以熊果酸、齊墩果酸總量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，見表2。

表2 Box-Behnken中心組合因素水平表

以Design-Expert 8.0軟件對表2結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，以熊果酸、齊墩果酸總量為響應(yīng)值，結(jié)果見表3，得到擬合方程：

Y(%)=-0.501 63-0.000 768 5×A+0.031 530×B+0.161 48×C+0.000 415 5×AB+0.003 845×AC-0.000 295×BC-0.006 369 9×A2-0.000 270 975×B2-0.015 543×C2(r=0.997 3，P<0.000 1)

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

注：1.木瓜燙制5 min，蒸制5 min，70 ℃干燥6 h所得。

方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4，擬合得到的回歸方程P<0.01，表明該模型在本試驗(yàn)研究范圍內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因素A、B、C、AC、AB、A2、B2、C2對飲片中熊果酸和齊墩果酸含量的影響差異極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，因素BC對其影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，所選因素之間存在顯著的交互作用。本模型差異極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，失擬項(xiàng)P=0.156 1>0.05，相對于絕對誤差差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高，誤差小，可以用于優(yōu)選宣木瓜藥材、飲片一體化加工工藝。

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行擬合，直觀了解各因素之間兩兩交互作用對宣木瓜藥材、飲片一體化加工工藝的影響，見圖2～4。圖2、圖3分別顯示了蒸制時間與干燥溫度交互作用、蒸制時間與干燥時間交互作用的影響，兩張圖響應(yīng)面坡度陡峭，其等高線為橢圓形，說明這兩個交互作用較強(qiáng)，對齊墩果酸和熊果酸總含量的影響顯著。圖4顯示了干燥時間與干燥溫度的交互作用，此響應(yīng)面坡度平緩，等高線近似圓形，說明干燥溫度與干燥時間的交互作用較弱，對飲片中齊墩果酸和熊果酸含量的影響較小。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

注：P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P<0.01為差異極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)Design-Expert 8.0軟件分析計(jì)算，宣木瓜飲片加工的最佳工藝：燙制時間為5 min，蒸制時間為3.52 min，干燥溫度為60 ℃，干燥時間為5.05 h，理論計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量為0.818 9%，為方便操作，將最佳工藝修正為燙5 min，繼續(xù)蒸4 min，60 ℃干燥5 h。

注：OAUA：齊墩果酸、熊果酸總含量。下同。圖2 蒸制時間與干燥溫度的交互作用響應(yīng)面及等高線

圖3 蒸制時間與干燥時間的交互作用響應(yīng)圖及等高線

圖4 干燥時間與干燥溫度的交互作用響應(yīng)面及等高線

3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

取鮮宣木瓜6個，按照優(yōu)化出的最佳一體化工藝加工，打粉，過100目篩，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)HPLC法測定熊果酸和齊墩果酸的總量，平行3份，得出熊果酸和齊墩果酸的總含量分別為0.816 2%、0.814 0%、0.817 8%，平均含量為0.816 0%，與預(yù)測值0.818 9%的相對誤差為0.35%，證明回歸模型較為準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化出的一體化加工工藝具有良好的重復(fù)性和可操作性。

4 討論與結(jié)果

經(jīng)預(yù)試，宣木瓜經(jīng)燙5 min，繼續(xù)蒸5 min齊墩果酸和熊果酸的總含量高于未蒸制的宣木瓜，故將蒸制時間作為考察因素之一。同時宣木瓜在沸水中燙5 min，外觀達(dá)到中華人民共和國藥典要求的灰白色，繼續(xù)延長燙制時間，宣木瓜表皮炸裂，切片不易成形，且齊墩果酸和熊果酸含量減少，故將燙制時間確定為5 min，結(jié)果見表1。另外，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，宣木瓜切片，50 ℃干燥6 h后呈濕軟狀，其含量不符合中華人民共和國藥典中對水分的要求，與60 ℃干燥6 h產(chǎn)品相比其有效成分無明顯提高，且繼續(xù)延長干燥時間則增加加工成本，不利于本工藝的推廣，故將干燥溫度的考察范圍定為60～80 ℃。

《中華人民共和國藥典》2010版規(guī)定木瓜藥材夏、秋二季果實(shí)綠黃時采收，置沸水中燙至外皮灰白色，對半縱剖，曬干。木瓜飲片需洗凈，潤透或蒸透后切薄片，曬干。宣木瓜傳統(tǒng)的炮制加工方法周期長，易受自然環(huán)境影響發(fā)生霉變腐爛等。按照《中華人民共和國藥典》2010版木瓜項(xiàng)下炮制方法，所制得宣木瓜飲片中齊墩果酸和熊果酸的總含量為0.688 8%。采用經(jīng)過響應(yīng)曲面法優(yōu)化的藥材飲片一體化加工工藝所得飲片中齊墩果酸和熊果酸的總含量為0.816 0%。其原因可能是宣木瓜藥材產(chǎn)地加工、飲片炮制一體化工藝省去了分段加工所導(dǎo)致的再次水處理與重復(fù)干燥過程，從而降低了有效成分的損失。同時一體化工藝有效地提高了宣木瓜飲片的加工效率，節(jié)約了時間，降低了能源消耗成本。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 丁黎艷，郭晏華，黃婷，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化補(bǔ)骨脂炮制工藝[J].中國現(xiàn)代中藥，2014，23(6)：692-697.

[3] 李光，李學(xué)蘭，孫慧峰，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取條件[J].中國現(xiàn)代中藥，2012，21(8)：917-920.

[4] 朱晨晨，程菁菁，謝曉梅，等.中藥木瓜水溶性總有機(jī)酸含量比較[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25(3)：75-76.

[5] 嚴(yán)宜昌，黃鶴，萬明.兩種產(chǎn)地初加工方法對木瓜藥材質(zhì)量的影響研究[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，11(4)：27-29.

[6] 黃鶴，嚴(yán)宜昌，萬明，等.兩種初加工方法對木瓜藥材的影響[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，27(4)：91-94.

[7] 王曉閣，龍全江，周宙，等.不同產(chǎn)地加工法對宣木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸含量的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(11)：75-78.

[8] 修彥鳳，曹艷花，王平，等.多指標(biāo)綜合評價優(yōu)選木瓜潤法和蒸法軟化的炮制工藝[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(5)：1247-1249.

[9] 王光寧，楊銀鳳，陳秋蘭，等.木瓜不同炮制品中水溶性有機(jī)酸的含量比較[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6(22)：5-6.

[10] 王光寧，崔升淼，梁炳健.炮制方法對木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量的影響[J].齊魯藥事，2013，31(12)：695-697.

[11] 陳洪燕，萬明，嚴(yán)宜昌，等.兩種產(chǎn)地木瓜不同處理方法的HPLC指紋圖譜研究[J].湖北中醫(yī)雜志，2010，32(2)：72-73.

OptimizationofIntegratedProcessingTechnologyforMedicinalMaterialsandDecoctionPiecesofChaenomelesspeciosabyBox-BehnkenDesignandResponseSurfaceMethod

QIANYan，YUSheng，SHANMingqiu，YAOWeifeng，ZHANGLi*

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，andNationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To establish and optimize the appropriate integrated processing technology of medicinal materials and decoction pieces of Chaenomeles Speciosa.Methods：The appearance character and content of oleanolic acid and ursolic acid were set as the study indicators to investigate the impact of the steaming time，drying temperaturer and drying time onChaenomelesspeciosa.The Box-Benhnken central composite design in the response surface analysis was adopted to optimize the preparation conditions.Results：The appropriate integrated processing technology was follows：the time of heating up in hot water was 5 minutes，the steaming time was 4 minutes，the drying temperature was 60 ℃，and the drying time was 5 hours.Conclusion：Compared with the traditional processing technology，the integrated processing technology ensures the drug quality，reduces the cost of production and improves production efficiency.

Chaenomelesspeciosa；integrated processing；response surface method

2015-04-14)

2011江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)首批重點(diǎn)項(xiàng)目(ZDXM-1-3)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(YSXK-2014)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015A070)

*

張麗，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：中藥炮制與質(zhì)量控制研究；Tel：(025)85811509， E-mail：zhangliguanxiong@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.017