尹紅衛(wèi)，潘蘇華

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210023；2.上?？房蛋录夹g(shù)有限公司，上海 201108)

HPLC測(cè)定復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮醇苷的含量△

尹紅衛(wèi)1，2，潘蘇華1*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210023；2.上?？房蛋录夹g(shù)有限公司，上海 201108)

目的：建立復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊銀杏黃酮醇苷的HPLC測(cè)定方法。方法：色譜柱為漢邦C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長為360 nm；柱溫為30 ℃。結(jié)果：槲皮素、山柰素、異鼠李素分別在12.8～63.8 μg·mL-1、12.9～64.4 μg·mL-1、2.6～13.2 μg·mL-1線性關(guān)系良好，平均回收率槲皮素為99.48 %，山柰素為102.69%，異鼠李素為100.15 %。結(jié)論：該測(cè)定方法簡便易行、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮醇苷的質(zhì)量控制。

復(fù)方；銀杏葉刺梨膠囊；黃酮醇苷；含量測(cè)定

近年來，高血脂并發(fā)癥有逐年上升的趨勢(shì)，高甘油三酯血癥作為高血脂中最常見的類型愈加被重視。目前降甘油三酯(TG)首選貝特類，但此類藥易引起轉(zhuǎn)氨酶升高、腹瀉、急性肝損傷等諸多不良反應(yīng)。國外研究早就發(fā)現(xiàn)銀杏葉制劑有較好的降TG的作用，但是其中含有毒性物質(zhì)銀杏酸(GA)，口服偶見有惡心、嘔吐等胃腸道不良反應(yīng)或過敏反應(yīng)[1]，市場缺乏安全有效的降TG藥物。復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊采用具有健脾消食、保肝護(hù)肝的刺梨與銀杏葉提取物配伍，能有效降低銀杏酸的毒副作用[2]，更加有利于高血脂癥等老年性疾病的預(yù)防和治療。本研究采用HPLC對(duì)復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中的槲皮素、山柰素和異鼠李素3種銀杏葉萜黃酮醇苷進(jìn)行定量分析，目的是建立一個(gè)能夠有效控制該膠囊內(nèi)在質(zhì)量的方法，以利于臨床更廣泛、更安全地使用。此方法簡單快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 series高效液相色譜儀(G1311二元高壓梯度泵、G1329B脫氣機(jī)、1290 Infinity 二極管陣列檢測(cè)器、7693A自動(dòng)進(jìn)樣器，美國Agilent 公司)；AG285電子天平(0.01 mg，METTLER，SWITERLAND)；KQ-250DB型數(shù)顯超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 材料

對(duì)照品槲皮素、山柰素、異鼠李素(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為0081-9304，110861-200606，110860-200407；含量分別為98.1%，98.3%，98.4%)；銀杏葉提取物(江蘇富偉生化制品有限公司，批號(hào)：130616)；甲醇、鹽酸(AR，南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為060614871，061130589)；重蒸水(娃哈哈飲用純凈水)；磷酸(AR，上海久億化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130320)；明膠空心膠囊(藥用級(jí)，安徽黃山膠囊股份有限公司，批號(hào)：20130408)；復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊(自制，批號(hào)分別為20140104，20140111，20140123)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)；檢測(cè)波長為360 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算不得低于2500。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取對(duì)照品槲皮素(quercetin，Q)6.38 mg、山柰素(kaempferol，K)6.44 mg、異鼠李素(isorhamnetin，I)1.32 mg置100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得槲皮素、山柰素、異鼠李素質(zhì)量濃度分別為63.8、64.4、13.2 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

取復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱定，加甲醇30 mL溶解，再加25%鹽酸溶液5 mL，置90 ℃水浴加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，于12 000 r·min-1離心15 min后即得，備用。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例制備不含銀杏葉提取物的陰性樣品，按照2.3方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

精密量取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品溶液，供試品溶液，陰性對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，結(jié)果見圖1?？梢姽┰嚻放c槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品相應(yīng)位置有吸收，而陰性對(duì)照無吸收，表明其他成分對(duì)銀杏黃酮醇苷的測(cè)定無干擾。

1.槲皮素；2.山柰素；3.異鼠李素A.混合對(duì)照品；B.復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊供試品；C.刺梨陰性供試品。圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2的槲皮素、山柰素、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為槲皮素：Y=13 547X+1.947 6，r=0.999 9；山柰素：Y=12 593X-7.085 7，r=0.999 7；異鼠李素：Y=13 447X-2.933 3，r=0.999 4。結(jié)果表明槲皮素在12.8～63.8 μg·mL-1，山柰素在12.9～64.4 μg·mL-1，異鼠李素在2.64～13.2 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取2.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.38%、0.69%、2.31%，表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊(批號(hào)：20140104)內(nèi)容物，按2.3方法制備供試品溶液，分別在供試品溶液制備后0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.87%、0.68%、1.17%，表明供試品溶液在室溫條件下放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊(批號(hào)：20140104)內(nèi)容物，平行6份，按2.3方法分別制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中槲皮素、山柰素、異鼠李素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.72 mg·g-1、5.68 mg·g-1、1.28 mg·g-1，RSD分別為1.7%、1.5%、1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊(批號(hào)：20140104)內(nèi)容物約0.36 g，共6份，加入槲皮素對(duì)照品溶液(63.8 μg·mL-1)12 mL、山柰素對(duì)照品溶液(64.4 μg·mL-1)8 mL、異鼠李素對(duì)照品溶液(13.2 μg·mL-1)9 mL，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果槲皮素的平均回收率為99.48%，RSD值為2.74%；山柰素的平均回收率為102.69%，RSD值為1.35%；異鼠李素的平均回收率為100.15%，RSD值為2.81%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。加樣回收率數(shù)據(jù)見表1～3。

表1 槲皮素的回收率考察

表2 山柰素回收率考察

表3 異鼠李素回收率考察

2.11 樣品測(cè)定

取3批復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊(批號(hào)分別為20140104，20140123，20140111)，按2.3方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣并測(cè)定槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積，依照《中華人民共和國藥典》2010版規(guī)定，銀杏黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51[3]。結(jié)果見表4。

表4 復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本試驗(yàn)中銀杏總黃酮醇苷的含量測(cè)定是通過3個(gè)黃酮單體的含量換算而來的。銀杏葉提取物中大部分黃酮苷類化合物的水解產(chǎn)物為槲皮素、山柰素、異鼠李素3種黃酮苷元，刺梨汁粉水解產(chǎn)物中黃酮苷類成分主要是以楊梅素、槲皮素、山柰素為母核的黃酮苷元[4-5]。復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中刺梨的用量較低[6]，比較發(fā)現(xiàn)陰性制劑中刺梨水解后生成的槲皮素等成分含量極低，經(jīng)測(cè)定其含量小于各待測(cè)成分含量的1%，對(duì)復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏葉總黃酮醇苷的含量測(cè)定產(chǎn)生的干擾可忽略。

本研究參考《中華人民共和國藥典》2010版一部，銀杏葉項(xiàng)下總黃酮苷含量測(cè)定方法，以甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)為流動(dòng)相測(cè)定復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中總黃酮醇苷含量，各成分的分離效果良好，符合中藥質(zhì)量分析要求。

試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡便可行，靈敏度高，重復(fù)性好，可為復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

[1] 王琛，李昌煜.銀杏葉提取物藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2009，11(3)：10-12.

[2] 潘蘇華，吳麗.復(fù)方銀杏葉制劑配伍減毒初步研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(6)：389-390

[3] 國家藥典委員會(huì)，中華人民共和國藥典：一部[S]北京，中國醫(yī)藥科技出版社，2010：904-905.

[4] 鄧朝暉.HPLC法測(cè)定復(fù)方銀杏葉膠囊中總黃酮醇苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(3)：249-250.

[5] 李利鋒，孫國祥.銀杏葉片HPLC定量指紋圖譜和4個(gè)成分含量測(cè)定[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(12)：52-56.

[6] 董玉中，潘蘇華，張麗.HPLC法比較與不同比例刺梨汁配伍前后銀杏酸的含量變化[J].黑龍江醫(yī)藥，2009，22(5)：601-602.

DeterminationofflavonolglycosidesinCompoundGinkgoandRosaroxburghiicapsule

YIN Hongwei1，2，PANSuhua1*

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanghaicoloronCoLtd，Shanghai201108，China)

Objective：To determine the content of flavonol glycosides in Compound Ginkgo and Rosa roxburghii capsule.Methods：The HPLC method was established for the determination of the flavonol glycosides in Compound Ginkgo and Rosa roxburghii capsule.The HPLC was performed on Hanban C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)column，mobile phase consisted methanol -0.4% phosphoric acid(50∶50).column temperature 30 ℃，and flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 360nm.Results：A good linearity was obtained in the range of 12.8-63.8 μg·mL-1of quercetin，12.9-64.4 μg·mL-1of kaempferide and 2.6-13.2 μg·mL-1of isorhamnetin.The average recovery rates of quercetin，kaempferide and isorhamnetin were 99.48%，102.69 % and 100.15 %，respectively.Conclusion：The established method is simple，accurate and sensitive，and suitable for quality control of Compound Ginkgo and Rosa roxburghii capsule.

Compound；Ginkgo and Rosa roxburghii capsule；flavonol glycosides；determination

2014-10-14)

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(2011ZYX6-010)

*

潘蘇華，教授，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：中藥藥理及保健產(chǎn)品研發(fā)，E-mail：13851664089@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.014