臧曉韻，趙琪，胡海峰*

(1.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海 201106；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040)

·中藥工業(yè)·

馬黛茶中綠原酸水提取工藝研究△

臧曉韻1，趙琪2，胡海峰2*

(1.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海 201106；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040)

目的：建立馬黛茶中綠原酸水提取優(yōu)化工藝。方法：以加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)法測定馬黛茶水提樣品中綠原酸含量，通過浸提時(shí)間、浸提水溫、茶水比3因素3水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定最佳工藝。結(jié)果：馬黛茶的最優(yōu)水提取工藝：浸提溫度75 ℃；料液比1∶35；浸提時(shí)間15 min。在優(yōu)化的提取工藝條件下，馬黛茶中綠原酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(4.99±1.36) mg·g-1。結(jié)論：水提馬黛茶綠原酸的方法簡便可行，可用于馬黛茶原料中綠原酸的含量檢測，有利于馬黛茶的科學(xué)泡茶并提高其營養(yǎng)價(jià)值。

馬黛茶；水提工藝；綠原酸；加壓毛細(xì)管電色譜法；定量分析

ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040)

馬黛茶，又名巴拉圭茶(Ilex paraguariensis)，屬冬青科冬青屬，原產(chǎn)于南美，由南美洲獨(dú)有的馬黛樹葉精制而成，與咖啡、茶(紅茶和綠茶)并稱“世界三大茶”[1-2]。其具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌、保護(hù)心腦血管、減肥、消炎和免疫調(diào)節(jié)等活性[3]。中華人民共和國衛(wèi)生部公告(2004年第6號(hào))也已將巴拉圭茶凈油或提取物列入食品用香料名單。成品的馬黛茶呈翠綠或淺翠綠的碎末狀，香氣獨(dú)特，味有點(diǎn)苦澀。目前，有商家將馬黛茶以草莓、蘋果、檸檬、橙子等不同的水果味呈現(xiàn)，來滿足不同消費(fèi)者的口味。還有各種以馬黛茶為主要成分的藥茶，如改善睡眠的、鎮(zhèn)痛的、止瀉的。

馬黛茶是一種純天然的飲品，與中國傳統(tǒng)的綠茶、紅茶有著顯著性差異：馬黛茶的主要藥理活性成分為綠原酸類物質(zhì)，卻不含兒茶素類物質(zhì)；另外，研究發(fā)現(xiàn)[2，4]，馬黛茶多酚的含量、抗氧化性能均比綠茶高，其沖泡方法也決定了多酚的攝入量。目前，關(guān)于馬黛茶的提取，國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道較少，而且分析方法也主要借助于高效液相分析，出峰時(shí)間較晚，樣品和試劑量消耗較大。本文選用本課題組建立的一種高效、低耗、準(zhǔn)確的馬黛茶綠原酸的加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)分析方法，首次對馬黛茶的水提取工藝進(jìn)行研究，旨在為開發(fā)馬黛茶的功能提供參考。

1 儀器與方法

1.1 儀器與試藥

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜儀(上海通微分析技術(shù)有限公司)，包括2臺(tái)高壓輸液模塊，微流控模塊，可變波長紫外檢測器(190～800 nm)，高壓電源模塊(±30 kV)；KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；實(shí)驗(yàn)pH計(jì)(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)。

綠原酸對照品(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：131101)，純度≥98%；馬黛茶(巴西原裝伯隆馬黛茶1000克，上海伯隆食品有限公司)；乙腈(上海人民化工廠)色譜純；水為娃哈哈純凈水；磷酸、氨水(上海試劑一廠)分析純；其他試劑(上海國藥集團(tuán))均為分析純。

1.2.1 色譜條件 毛細(xì)管填充柱(蘇州環(huán)球色譜責(zé)任有限公司，EP-100-20/45-3-C18內(nèi)徑100 μm，毛細(xì)管全長45 cm，有效長度20 cm，ODS填料粒徑3 μm)；流動(dòng)相A為10%甲醇+磷酸(pH2.5，2 mM)，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min 5%B、1～15 min 5%B～9%B、15～20 min 9%B～20%B、20～40 min 20%B；檢測波長為325 nm；流速為0.07 mL·min-1；電壓為-10 KV。

1.2.2 供試品溶液的制備 將馬黛茶低溫干燥后，粉碎成粗粉(過60目篩)，稱取干燥的馬黛茶粉末1 g，加入35 mL水，置于75 ℃的水浴鍋中浸提15 min，抽濾，用水定容于50 mL容量瓶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

1.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品4.0 mg，加入流動(dòng)相甲醇-乙腈-磷酸(2∶5∶18)定容于5 mL容量瓶中，制成對照品儲(chǔ)備液。使用時(shí)根據(jù)需要用流動(dòng)相稀釋至相應(yīng)的濃度。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限 將對照品儲(chǔ)備液分別進(jìn)行梯度稀釋，制成一系列梯度，質(zhì)量濃度分別為0.048、0.100、0.200、0.400、0.800 mg·mL-1的對照溶液，按最優(yōu)色譜條件進(jìn)行測定。以綠原酸對照樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=284 094X+2 688.3，r=0.999 4，表明綠原酸在0.048～0.800 mg·mL-1線性關(guān)系良好。檢出限和定量限分別為5、 15 μg·mL-1。

1.2.4.2 精密度 取對照品儲(chǔ)備液125 μL，定容于1 mL容量瓶。重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，得到綠原酸的RSD為1.70%，表明儀器精密度良好。

1.2.4.3 重復(fù)性 取同一批的供試品溶液6份，在最優(yōu)條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，得到綠原酸的RSD為1.68%，表明其重復(fù)性良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性 取供試品，分別于0、4、8、12 h進(jìn)樣測定，考察其穩(wěn)定性，得到綠原酸的RSD為1.66%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

按下按鍵時(shí)，通常都會(huì)有抖動(dòng)，表面上看來是按按鍵一次，但是因?yàn)榘存I的抖動(dòng)，單片機(jī)會(huì)判斷出按按鍵很多次，從而輸入不可控。此問題可以用“軟件消抖”來解決。當(dāng)?shù)谝淮螜z測到按鍵按下時(shí)，不采取動(dòng)作，延時(shí)一段時(shí)間后，按鍵按下信號(hào)依然存在，則認(rèn)為按鍵被按下，再執(zhí)行相應(yīng)的動(dòng)作。

1.2.4.5 回收率 吸取對照品溶液各40、50、60 μL，加入供試品溶液，定容于1 mL容量瓶中，共3份，制備低、中、高濃度的供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。綠原酸的回收率如表1所示。

表1 馬黛茶中綠原酸的回收率

2.1 提取時(shí)間對綠原酸含量的影響

稱取1 g馬黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10加入10 mL的80 ℃水，置于80 ℃的水浴鍋中分別保溫5、15、25、45 min，過濾后定容至50 mL，測定平行樣，記錄峰面積，計(jì)算綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，在0～15 min內(nèi)，綠原酸的含量隨著時(shí)間的增加而增加；在15 min時(shí)，綠原酸的含量達(dá)到最大；在15～25 min內(nèi)，綠原酸含量隨著時(shí)間的增加而減少；25～45 min內(nèi)，綠原酸含量略有增加。見圖1。因此，選擇15 min提取時(shí)間作為后續(xù)的優(yōu)化條件。

圖1 提取時(shí)間對綠原酸提取量的影響

2.2 提取溫度對綠原酸量的影響

稱取1 g馬黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10分別加入10 mL的60、70、80、100 ℃水，置于對應(yīng)溫度的水浴鍋中保溫15 min，過濾后定容至50 mL，測定平行樣，記錄峰面積，計(jì)算綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，在80 ℃時(shí)，綠原酸的含量達(dá)到最大。見圖2。因此，選擇水提溫度80 ℃作為后續(xù)的優(yōu)化條件。

圖2 提取溫度比對綠原酸提取量的影響

2.3 料液比對提取綠原酸的影響

稱取1 g馬黛茶于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶10、1∶30、1∶40、1∶50分別加入10、30、40、50 mL的80 ℃水，置于對應(yīng)溫度的水浴鍋中保溫15 min，過濾后定容至50 mL，測定平行樣，記錄峰面積，計(jì)算綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，在料液比1∶30時(shí)，綠原酸的含量達(dá)到最大。見圖3。因此，選擇1∶30作為最優(yōu)料液比。

圖3 提取料液比對綠原酸提取量的影響

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定料液比、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表2，結(jié)果見表3、表4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

由表3的極差分析結(jié)果可知，對綠原酸提取影響程度最大的是溫度，其次是時(shí)間，最后是料液比。且由表4深入分析可知，溫度(A)和時(shí)間(C)的影響極其顯著，微小的變化即引起指標(biāo)的顯著變化，料液比(B)的影響非常顯著。根據(jù)表3中K值比較，得出理論上最佳提取工藝條件為A1B3C2，而正交試驗(yàn)中此方案不存在，故以此條件進(jìn)行分析，得出綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.982 mg·g-1，大于正交試驗(yàn)方案A1B2C2，確定最佳水提工藝為浸提溫度為75 ℃，料液比為1∶35，水浴15 min。

2.5 馬黛茶水提工藝穩(wěn)定性及其綠原酸的含量測定

在2.4所確定的最佳工藝條件下，取5份干燥茶葉各1 g于100 mL三角瓶中，按照料液比1∶35加入35 mL的75 ℃水，置于75 ℃的水浴鍋中保溫15 min，過濾后定容至50 mL，依法測定馬黛茶中的綠原酸含量。結(jié)果見表5、圖4。

表5 最佳水提工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

注：A.對照品；B.供試品。圖4 綠原酸對照品 試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，按照最佳沖泡工藝條件，馬黛茶中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(4.999±1.361) mg·g-1。

3 討論

馬黛茶是阿根廷的“國寶”、“國茶”，現(xiàn)已被公認(rèn)為目前世界上已知的營養(yǎng)保健及藥用功效全面的單科植物健康飲品。其含有豐富的活性成分，具有抗氧化、抗癌、減肥、抗心腦血管疾病等藥理作用，已經(jīng)引起各國學(xué)者的關(guān)注。由于中國引進(jìn)馬黛茶較晚，人們對于其日常飲用知之甚少，本文從日常沖泡的角度出發(fā)進(jìn)行研究，貼近生活，更有利于馬黛茶保健作用的開發(fā)。

pCEC是一種新興的微分離技術(shù)，它結(jié)合了電泳的高效性和高效液相色譜的保留機(jī)制，與傳統(tǒng)的分析手段相比，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、試劑和樣品消耗少等突出優(yōu)點(diǎn)[5]，近幾年開始也用于中藥活性成分分析[6]，并顯現(xiàn)出了極大的潛力。本課題組通過優(yōu)化流動(dòng)相和分離電壓等一系列條件，建立了一種高效、低耗、準(zhǔn)確的分析方法，并成功應(yīng)用于馬黛茶的水提工藝優(yōu)化，顯示出了pCEC在提取馬黛茶中綠原酸的分析方面的巨大優(yōu)勢，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

另外，本試驗(yàn)還以新綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C為指標(biāo)，設(shè)計(jì)了同樣的正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，溫度、時(shí)間、料液比對以上化合物的提取無明顯影響(數(shù)據(jù)待報(bào)道)，而綠原酸在馬黛茶沖泡過程中受溫度、時(shí)間、料液比的影響較大，猜測可能是由于綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵、不飽和鍵及多元酚而不穩(wěn)定，受溫度變化而發(fā)生水解和氧化反應(yīng)[7]，故選擇綠原酸為指標(biāo)進(jìn)行沖泡工藝的研究。本試驗(yàn)為馬黛茶的日常飲用提供有力的理論依據(jù)，也將促進(jìn)馬黛茶豐富的活性成分及藥理功能為我國人民所用。

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StudiesonWaterExtractionTechnologyofChlorogenicacidsfromMateTea(Ilexparaguariensis)

ZANGXiaoyun1，ZHAOQi2，HUHaifeng2*

(1.ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai201106；2.StateKeyLab.ofNewDrugandPharmaceuticalProcess，ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry，

Objective：To improve water extraction technology of chlorogenic acid from Mate Tea(Ilexparaguariensis).Methods：Using pressurized capillary electrochromatogaphy，the amount of chlorogenic acids in water extraction solution was determined and the extraction process was improved through 3 factors(extraction time，temperature and ratio of tea and water)and 3 levels orthogonal design.Results：The results indicated that the optimal extraction process was as follows：extraction temperature 75 ℃，ratio of material to liquid 1∶35 and extraction time 15 min.The average content of chlorogenic acids in Mate Tea(I.paraguariensis)was 4.99±1.36 mg·g-1under this condition.Conclusion：It is feasible and simple to extract chlorogenic acid from Mate Tea by means of water extracting technology for measuring chlorogenic acid and providing the method for daily drinking-tea.

Mate tea；water extraction technology；chlorogenic acid；pressurized capillary electrochromatogaphy；quantification

2014-07-14)

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2011YQ15007208)；國家重大專項(xiàng)(2014zx09201001-012)；“十二五”大平臺(tái)子課題(X-2-3)和上海市科技支撐項(xiàng)目(12431901102)

*

胡海峰，男，博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向：微生物分類、微生物生理與代謝、微生物藥學(xué)開發(fā)；Tel：(021)62892873，E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.012