盧聰，鮑勇剛，趙樹民，賈韋國，劉新民*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.北京博肽健諾威生物技術(shù)有限公司，北京 100085；3.加拿大UBC大學(xué)，加拿大)

·基礎(chǔ)研究·

不同產(chǎn)地人參蛋白差異研究△

盧聰1，鮑勇剛2，趙樹民2，賈韋國3，劉新民1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.北京博肽健諾威生物技術(shù)有限公司，北京 100085；3.加拿大UBC大學(xué)，加拿大)

目的：進(jìn)行不同產(chǎn)地人參差異蛋白的研究。方法：首先確定人參蛋白的提取方法以及膜雜交實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)而使用多肽陣列與不同產(chǎn)地的人參蛋白進(jìn)行雜交。結(jié)果：不同產(chǎn)地人參蛋白有明顯差異，其中高緯度地區(qū)(遜克、木蘭)人參蛋白與低緯度地區(qū)(長白、集安、撫松)人參蛋白間差異較大，同一緯度地區(qū)人參蛋白差異較小。結(jié)論：多肽陣列技術(shù)能夠進(jìn)行不同生長條件下人參差異蛋白的研究，不同產(chǎn)地的人參蛋白具有明顯的差異。此外，獲得人參蛋白特征性表達(dá)圖譜，可用于人參的鑒定。

人參；蛋白；多肽陣列；差異

人參是國內(nèi)外公認(rèn)的藥用保健珍品，為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，被譽(yù)為“百草之王”。我國具有悠久的人參栽培及使用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“人參補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心益智，久服輕身延年?！泵鞔顣r(shí)珍《本草綱目》對人參做出更詳細(xì)記載：“人參能補(bǔ)五臟血脈，益氣生血，故為強(qiáng)壯藥，能振奮精神”?，F(xiàn)代大量研究表明，人參及其制品具有抗衰老[1-2]、抗腫瘤[3-4]、改善記憶力[5]、增強(qiáng)免疫力[6-7]等作用，同時(shí)對治療心血管疾病[8]、糖尿病[9]、腦部疾病[10]等均有很好的療效。

人參根中成分復(fù)雜，迄今已知其中含有人參皂苷、多糖、揮發(fā)油、脂肪酸、甾醇、維生素、蛋白質(zhì)、多肽等多種有效成分[11-12]。但目前人們的研究主要集中于人參皂苷及揮發(fā)性成分上，對蛋白質(zhì)及多肽的研究相對較少[13]，本文利用多肽陣列技術(shù)，對不同產(chǎn)地人參蛋白差異進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的人參蛋白具有明顯的差異。

1 材料

人參選取五年生栽培參，分別產(chǎn)自黑龍江遜克縣、黑龍江木蘭縣、吉林長白縣、吉林撫松縣、吉林集安縣，新鮮采摘，-80 ℃保存。所有化學(xué)試劑均使用進(jìn)口分析純。

植物蛋白提取試劑盒(國產(chǎn)，上海生工生物工程有限公司)；植物蛋白提取試劑盒(國產(chǎn)，普利萊公司)；BCA蛋白定量試劑盒、植物蛋白提取試劑盒、蛋白標(biāo)記試劑盒(Pierce公司)。

2 方法

2.1 采集運(yùn)輸保存

人參種植地現(xiàn)場采集，液氮保存，干冰運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存。

2.2 人參蛋白提取

按提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司植物蛋白提取試劑盒、普利萊公司植物蛋白提取試劑盒、Pierce植物蛋白提取試劑盒)說明書操作。

2.3 人參蛋白定量

按Pierce公司BCA蛋白定量試劑盒說明書操作。

2.4 人參蛋白生物素標(biāo)記

按Pierce蛋白標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記，具體步驟如下：

1)根據(jù)試劑盒公式計(jì)算標(biāo)記需要的生物素用量；

2)使用170 μL的PBS(pH7.2)溶液溶解Biotin，獲得濃度為20 mmol的標(biāo)記用Biotin溶液；

3)根據(jù)計(jì)算結(jié)果，加入100 μL的Biotin溶液至1 mg的純化蛋白溶液中(0.5～2 mL)，室溫反應(yīng)1 h或冰浴反應(yīng)2 h；

4)PBS平衡脫鹽柱后，加入標(biāo)記蛋白反應(yīng)液，離心2 min；

5)收集過柱溶液即生物素化蛋白溶液，BCA法定量，剩余蛋白溶液4 ℃保存；

6)使用試劑盒HABA方法檢測生物素標(biāo)記效果。

2.5 人參蛋白生物素標(biāo)記效率檢測

實(shí)驗(yàn)步驟與常規(guī)WB實(shí)驗(yàn)相同，生物素化蛋白SDS-PAGE，蛋白條帶轉(zhuǎn)膜，洗膜，HRP-Streptavidin(使用比例1∶20 000)與膜共孵育，洗膜，顯色照相。

2.6 隨機(jī)多肽陣列膜合成

配制0.25 mol·L-1Fmoc-氨基酸溶液；封閉液Ⅰ(2% acetic anhydride 于DMF)；封閉液Ⅱ(2% acetic anhydride+2% DIPEA于DMF)；Fmoc-移除液(20%piperidine于DMF)。

活化的膜放置于全自動(dòng)合成儀上；根據(jù)程序自動(dòng)轉(zhuǎn)移Fmoc-氨基酸溶液到活化膜上的特定位置，與膜進(jìn)行反應(yīng)2×20 min；膜按序浸入封閉液Ⅰ中和封閉液Ⅱ中，進(jìn)行側(cè)鏈封閉；用DMF清洗膜4次；膜放入去保護(hù)溶液中2次，用于移除氨基端的Fmoc保護(hù)基團(tuán)；去保護(hù)之后，用DMF清洗3次，而后再用乙醇干燥。重復(fù)以上步驟，直至多肽陣列全部合成完畢。全部合成后，用溶液去除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，再用二氯甲烷(CH2Cl2)清洗4次，而后用乙醇-20 ℃干燥，保存，用于下一步雜交反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

2.7 陣列膜與標(biāo)記蛋白雜交檢測

陣列膜激活及用封閉液封閉；生物素化待檢蛋白溶液(15 μg·mL，5 mL)與陣列膜4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，洗去未結(jié)合的生物素化待檢蛋白及其他雜質(zhì)；用封閉液稀釋的HRP-Streptavidin(稀釋比例1∶10 000)與陣列膜孵育；洗去未結(jié)合的標(biāo)記鏈霉親和素及其他雜質(zhì)；常用化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯色；數(shù)字成像設(shè)備照相，軟件分析顯色點(diǎn)灰度值，通過數(shù)據(jù)分析辨別陽性顯色點(diǎn)。

3 結(jié)果

3.1 人參蛋白提取方法的確定

為提取最佳的人參蛋白進(jìn)行后續(xù)抗體芯片雜交研究，評(píng)估不同的植物蛋白提取試劑盒提取人參蛋白的效率及效果，使用3種不同的植物蛋白提取試劑盒提取同一產(chǎn)地的人參蛋白。Pierce提取試劑盒提取步驟少，對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求低且提取效率最高，達(dá)到2%以上，見表1。蛋白電泳檢測三種不同提取試劑盒提取人參蛋白的質(zhì)量，結(jié)果如圖1所示，3種不同提取試劑盒提取的人參蛋白質(zhì)量差異較明顯，Pierce提取試劑盒提取蛋白更完整清晰，質(zhì)量更高。最終選擇Pierce提取試劑盒提取人參蛋白。

表1 不同人參提取試劑盒提取效率比較

1.蛋白Marker；2.Pierce試劑盒提取蛋；3.上海生工試劑盒提取蛋白；4.普利萊試劑盒提取蛋白。注：蛋白樣品量50 μg。 圖1 不同試劑盒提取蛋白質(zhì)量比較

3.2 人參蛋白標(biāo)記效率檢測

使用Pierce生物素標(biāo)記試劑盒進(jìn)行人參蛋白標(biāo)記后，為確保標(biāo)記效率，使用WB方法檢測標(biāo)記蛋白標(biāo)記效率。如圖2所示，轉(zhuǎn)膜后的生物素化蛋白用HRP-Streptavidin共孵育，化學(xué)發(fā)光試劑曝光壓片，結(jié)果整個(gè)蛋白條帶都有顯色，表明生物素標(biāo)記效率較高。

A.SDS-PAGE電泳圖(蛋白上樣量為20 μg)；B.WB檢測(蛋白電泳蛋白量為2 μg，HRP-Streptavidin的工作比例為1∶100 000)。注：1-1遜克的人參蛋白；2-1木蘭的人參蛋白；3-1長白的人參蛋白；4-1撫松的人參蛋白；5-1集安的人參蛋白。圖2 不同產(chǎn)地人參蛋白生物素標(biāo)記效率檢測

3.3 人參蛋白雜交條件

為確保合適的人參蛋白雜交效果，使用同一產(chǎn)地的生物素化人參蛋白與多肽陣列膜進(jìn)行雜交條件研究。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確定生物素化人參蛋白的雜交條件：生物素化蛋白濃度15 μg·mL-1，HRP-Streptavidin工作液稀釋比例為1∶10 000，見圖3。

3.4 人參蛋白表達(dá)差別比較

基于上述的研究結(jié)果，使用不同產(chǎn)地人參蛋白與合成的隨機(jī)多肽陣列膜進(jìn)行雜交反應(yīng)。在相同的反應(yīng)條件下，不同產(chǎn)地人參蛋白的顯色點(diǎn)有明顯的差異，如圖4所示。使用圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析這些差異點(diǎn)，從表2中可以看出，木蘭縣產(chǎn)人參的特征表達(dá)蛋白點(diǎn)數(shù)最高，其次是遜克，撫松、集安縣特征表達(dá)蛋白點(diǎn)數(shù)最少。

表2 不同產(chǎn)地人參蛋白表達(dá)差異點(diǎn)

3.5 人參蛋白表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)

分析上述5個(gè)不同產(chǎn)地的人參蛋白與隨機(jī)多肽陣列雜交圖譜，選擇所有圖譜中共有的陽性顯色點(diǎn)組成蛋白表達(dá)點(diǎn)圖譜，可用于人參的鑒定。如圖5A中，紅色圈出的顯色點(diǎn)組成的點(diǎn)陣，為本項(xiàng)目中5個(gè)產(chǎn)地人參蛋白的特征性表達(dá)譜。同樣的方法，分析長白、集安、撫松三地的蛋白雜交圖，共同的顯色點(diǎn)組成的點(diǎn)陣，即為上述三地人參蛋白的特征性蛋白表達(dá)譜，可用鑒定此三地的人參。

A.標(biāo)記蛋白雜交濃度25 μg·mL-1，HRP-鏈酶親和素使用濃度1∶5 000；B.標(biāo)記蛋白雜交濃度20 μg·mL-1，HRP-鏈酶親和素使用濃度1∶8 000；C.標(biāo)記蛋白雜交濃度15 μg·mL-1，HRP-鏈酶親和素使用濃度1∶10 000；D.標(biāo)記蛋白雜交濃度10 μg·mL-1，HRP-鏈酶親和素使用濃度1∶10 000；E.標(biāo)記蛋白雜交濃度6 μg·mL-1，HRP-鏈酶親和素使用濃度1∶10 000。圖3 生物素化人參蛋白與多肽陣列雜交條件

A.木蘭縣；B.遜克縣；C.長白縣；D.撫松縣；E.集安縣。圖4 不同產(chǎn)地人參雜交圖

A.人參蛋白差異表達(dá)譜；B.長白、集安、撫松三地差異蛋白表達(dá)譜。圖5 人參差異蛋白表達(dá)譜

3.6 差異蛋白鑒定

選擇上述差異點(diǎn)，鑒定后合成大點(diǎn)捕獲差異蛋白，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果如圖6所示。樣品檢測1 000～1 000 000Da沒有看到質(zhì)譜峰，分析原因可能是樣品含糖太高、帶電能力太弱，無法帶電飛行。

A1.樣品1分子量1 000～6 000Da；A2.樣品1分子量5 000～1 000 000Da；B1.樣品2分子量1 000～6 000Da；B2.樣品2分子量5 000～1 000 000Da。圖6 差異蛋白質(zhì)譜鑒定圖

3 討論

人參是我國傳統(tǒng)的中藥材，在我國具有廣泛、悠久的研究歷史。但之前的研究多集中于人參的活性成分，很少涉及人參蛋白。近年來進(jìn)行的人參蛋白鑒定研究也主要集中于人參中活性多肽的開發(fā)鑒定，對人參蛋白的研究多集中在皂苷代謝酶類及生理活性酶類。本實(shí)驗(yàn)是國內(nèi)外首次使用多肽陣列技術(shù)鑒定人參差異表達(dá)蛋白，與其他的組學(xué)方法相比，這一技術(shù)突出的優(yōu)勢在于受蛋白表達(dá)豐度的影響小，實(shí)驗(yàn)步驟簡單、易操作，結(jié)果也表明這一技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地人參中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。

目前常用的人參蛋白提取方法多為緩沖液浸提法，其優(yōu)點(diǎn)是蛋白提取得率高，缺點(diǎn)是處理過程復(fù)雜、時(shí)間較長、蛋白易降解。在本實(shí)驗(yàn)中，使用分子生物學(xué)提取方法進(jìn)行人參蛋白的提取，該方法相較于傳統(tǒng)的浸提法具有操作簡便、處理時(shí)間較短等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用分子生物學(xué)方法提取的人參蛋白能夠滿足后續(xù)膜雜交實(shí)驗(yàn)的需要。

人參中糖蛋白含量比較高，對后續(xù)鑒定會(huì)產(chǎn)生許多不利的影響。本實(shí)驗(yàn)在發(fā)現(xiàn)人參差異表達(dá)蛋白的基礎(chǔ)上，力圖使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的鑒定。但從結(jié)果來看，差異蛋白很有可能還是以糖蛋白為主，這為我們的質(zhì)譜鑒定帶來了極大的困擾。因此，可考慮在下一步研究過程中，對人參蛋白除糖后使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的鑒定。

總之，在本實(shí)驗(yàn)中，利用多肽陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地人參中存在差異表達(dá)蛋白質(zhì)，說明不同產(chǎn)地人參在蛋白表達(dá)上存在明顯的差別，這為我們進(jìn)一步深入研究提供參考。同時(shí)也表明多肽陣列技術(shù)可以用于差異化蛋白表達(dá)的發(fā)現(xiàn)及研究，這一技術(shù)的引進(jìn)，也必將對我國相關(guān)領(lǐng)域科研水平的提高發(fā)揮重要作用。

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DifferentialproteomicanalysisofPanaxginsengfromdifferenthabitats

LU Cong1，BAOYonggang2，ZHAOShumin2，JIAWeiguo3，LIUXinmin1*

(1.TheChineseAcademyofMedicalSciences，TheInstituteofMedicinalPlantDevelopment，Beijing100193，China；2.BeijingGenovaxBiotechCorporation，Beijing100085，China；3.UniversityofBritishColumbia，Canada)

Objective：To research differences between Ginseng protein fromPanaxginsengof different origins.Methods：The extraction methods of ginseng protein and the experiment conditions of membrane hybridization were established，and peptide arrays method was applied to hybrid with ginseng protein.Results：There were significant differences in Ginseng protein fromP.ginsengof different origins，in which the difference was significant between high latitude regions(XK、ML)and low latitude regions(CB、JA、XS)，and the difference was not obvious between the same latitude regions(XK and ML or CB、JA、XS).Conclusion：The polypeptide array technology can be used to research the ginseng protein ofP.ginsengof different origins and different growth conditions.Ginseng protein from different regions showed obvious difference.In addition，ginseng protein expression characteristic map can be used for the identification ofP.ginseng.

ginseng；protein；polypeptide arrays；differences

2014-10-14)

國際科技合作與交流專項(xiàng)——人參益智藥效與基因/蛋白表達(dá)譜關(guān)聯(lián)規(guī)律合作研究(2011DFA32730)；全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研項(xiàng)目——中長期航天飛行所致應(yīng)激損傷評(píng)價(jià)與防護(hù)關(guān)鍵技術(shù)研究(BWS11J052)

*

劉新民，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥神經(jīng)藥理學(xué)；Tel：(010)-57833245，E-mail：liuxinmin@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.002