徐雷，劉剛，劉朝選

(牡丹江市第一人民醫(yī)院 泌尿外科，黑龍江 牡丹江 157011)

·基礎(chǔ)研究·

姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)及凋亡的影響△

徐雷*，劉剛，劉朝選

(牡丹江市第一人民醫(yī)院 泌尿外科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的：評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞熱休克蛋白27(HSP27)mRNA表達(dá)及凋亡的影響，探討其抗前列腺癌的可能作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1和前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3和DU145。采用RT-PCR檢測(cè)各細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)情況。PC-3細(xì)胞隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組：不給藥；高劑量組：給予50 μmol·L-1姜黃素2 μL；低劑量組：給予25 μmol·L-1姜黃素2 μL；另設(shè)陰性對(duì)照組：給予等體積DMSO。采用RT-PCR檢測(cè)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)情況，采用TUNEL法檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：LNCaP、PC-3和DU145細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)明顯升高，與RWPE-1細(xì)胞比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥組PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)明顯降低，且呈劑量依賴性，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥組可見大量PC-3細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：姜黃素抑制HSP27 mRNA的表達(dá)和誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，可能是其抗前列腺癌的機(jī)制之一。

前列腺癌；姜黃素；PC-3細(xì)胞；熱休克蛋白27；細(xì)胞凋亡

熱休克蛋白27(heat shock proteins 27，HSP27)是熱休克蛋白家族的主要成員之一，其在正常組織和細(xì)胞中表達(dá)水平較低，在不同生物及物理因素的刺激條件下，HSP27出現(xiàn)高表達(dá)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，許多惡性腫瘤中HSP27高表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)與惡性腫瘤關(guān)系密切[2]。HSP27與臨床疾病特別是與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，但是有關(guān)HSP27在前列腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中所起的作用仍存在爭(zhēng)議。前列腺癌是威脅男性健康的一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，是美國男性中引起死亡的第二大癌癥，是55歲以上男性的第三位死因。我國前列腺癌的發(fā)病率雖低于歐美國家，但隨著我國人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來其發(fā)病率也在不斷地上升，且有迅速增加的趨勢(shì)[3-4]。我國前列腺癌的發(fā)病率因何低于歐美國家，許多學(xué)者設(shè)想可能與其飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)。有研究證實(shí)，黃酮、多酚類化合物被認(rèn)為是預(yù)防治療前列腺癌很有潛力的藥物。姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃根莖中提取得到的脂溶性酚類黃色色素，具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、抑制血管生成及特有的抗腫瘤活性[6]。本研究采用RT-PCR檢測(cè)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)情況，采用TUNEL法檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡情況，旨在評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)及凋亡的影響，探討其抗前列腺癌的可能作用機(jī)制。

1 材料

姜黃素和DMSO(Sigma公司)，人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1、前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3和DU145細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，F(xiàn)12培養(yǎng)液和胎牛血清(武漢凌飛科技有限公司)，TRIzol試劑盒(上海華舜公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Bestbio公司)，青霉素、鏈霉素和溴化乙啶等(碧云天生物技術(shù)研究所)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning 公司)。姜黃素使用DMSO配制成50 mmol·L-1儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用前用F12培養(yǎng)液分別配制成25、50 μmol·L-1溶液。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

RWPE-1、LNCaP、PC-3和DU145細(xì)胞分別保存在含有10%胎牛血清的F12營養(yǎng)培養(yǎng)基(含青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1)。按照細(xì)胞密度1×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。待80%細(xì)胞融合后，更換新鮮培養(yǎng)液，PC-3細(xì)胞隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組：不給藥；高劑量組：給予50 μmol·L-1姜黃素2 μL；低劑量組：給予25 μmol·L-1姜黃素2 μL；另設(shè)陰性對(duì)照組：給予等體積DMSO，收集培養(yǎng)液用于后續(xù)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟至少重復(fù)4次。

2.2 RT-PCR檢測(cè)HSP27 mRNA的表達(dá)

按照TRIzol試劑盒說明書抽提總RNA，溶于20 μL DEPC-H2O，依次加入2.5 μL DNA酶，2.5 μL 10×buffer，37 ℃水浴30 min后，65 ℃水浴10 min，分光光度法檢測(cè)RNA濃度。HSP27 PCR引物是：5′-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3′(正向)和5′-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3′(反向)，GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物：5′-GGTCAACGGGTAGGT-GTTTG-3′(正向)和5′-GCCTTTGGGCTCTGCATGAA-3′(反向)。HSP27 PCR反應(yīng)總體積25 μL。使用GeneAm P2400熱循環(huán)儀，預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(110 V，35 mA，30 min)，溴化乙錠染色，BandScan 5.0軟件進(jìn)行電泳結(jié)果吸光度積分值分析，HSP27 mRNA表達(dá)相對(duì)含量值(灰度比)=HSP27吸光度積分值/GAPDH吸光度積分值。

2.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響。將細(xì)胞用PBS沖洗，-20 ℃甲醇固定15 min，然后PBS沖洗細(xì)胞3次，加入50 μL TUNEL反應(yīng)液，避光37 ℃孵育1 h。PBS沖洗細(xì)胞，Hoechst 33258染料37 ℃染色10 min。凋亡指數(shù)= TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR檢測(cè)RWPE-1、LNCaP、PC-3和DU145細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)結(jié)果

HSP27 mRNA的表達(dá)結(jié)果依賴于前列腺癌細(xì)胞株的惡性程度，惡性程度越高，表達(dá)越高。RWPE-1細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)水平為90%，LNCaP、PC-3和DU145細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)水平分別為100%、115%和148%，與RWPE-1細(xì)胞比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

3.2 姜黃素對(duì)HSP27 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組PC-3細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)水平分別為128%、110%、50%、60%。高劑量組和低劑量組與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

3.3 PC-3細(xì)胞凋亡情況

姜黃素高劑量組和低劑量組可見大量凋亡PC-3細(xì)胞，且高劑量組高于低劑量組，呈劑量依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

注：與RWPE-1細(xì)胞比較，*P<0.05。圖1 RT-PCR檢測(cè)RWPE-1、LNCaP、PC-3和DU145細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)結(jié)果

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；下同。圖2 姜黃素對(duì)HSP27 mRNA表達(dá)的影響

圖3 姜黃素誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡情況(SP×200)

4 討論

HSP作為分子伴侶廣泛存在于原核與真核細(xì)胞體內(nèi)，參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)控以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要的生物學(xué)過程，是生物體內(nèi)具有廣泛和重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)[7]。Fuller等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HSP和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫、抗腫瘤治療以及腫瘤的預(yù)后等關(guān)系密切。HSP的表達(dá)不僅抑制細(xì)胞損傷而且對(duì)細(xì)胞的保護(hù)也起著重要作用，例如控制細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫反應(yīng)[9]。

HSP27是HSP亞家族成員之一，在多種腫瘤細(xì)胞中均有過表達(dá)，其主要的生物學(xué)功能是防止各種應(yīng)激因素對(duì)細(xì)胞的損傷。另外，HSP27還與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)[10]。近年來，研究HSP27與腫瘤的關(guān)系成為熱點(diǎn)。正常組織細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)水平很低，應(yīng)激狀態(tài)可致胞內(nèi)HSP27磷酸化并致其寡聚體解聚，HSP27表達(dá)上調(diào)。HSP27在腫瘤發(fā)病中的作用與其對(duì)細(xì)胞的影響有關(guān)，它在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中可與相關(guān)活性蛋白相互作用并抑制凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡，參與癌癥的發(fā)生[11-12]。同時(shí)，HSP27高表達(dá)能引起腫瘤細(xì)胞對(duì)柔紅霉素、甲氨蝶呤和長春新堿的耐藥性[13]。HSP27通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程[14]。HSP27的重要作用是控制肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化。HSP可通過腫瘤細(xì)胞伴侶分子抗原肽在啟動(dòng)危險(xiǎn)信號(hào)或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而保護(hù)腫瘤細(xì)胞。目前HSP27與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，但是有關(guān)HSP27在前列腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中所起的作用鮮見報(bào)道。Miyake等[15]報(bào)道，HSP27、HSP70、HSP90在前列腺癌細(xì)胞表達(dá)，但是根據(jù)Gleason評(píng)分和病理分期，只有HSP27表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且HSP27可作為前列腺癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。Thomas等[16]研究顯示，前列腺癌組織中不同細(xì)胞HSP27的著色強(qiáng)度有所不同，具有明顯的異質(zhì)性，也就是隨著癌組織分化程度的增高，HSP27的表達(dá)水平也隨之增高。本研究結(jié)果顯示HSP27的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的分級(jí)呈正相關(guān)，即前列腺癌細(xì)胞分級(jí)越高，其表達(dá)水平也就越高。說明癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、惡變，侵襲力等因素與HSP27的表達(dá)水平相關(guān)。本研究結(jié)果與其相一致。

姜黃素是從中藥姜黃中提取的活性成分，具有重要和廣泛的藥理作用，如抗突變、抗炎和抗腫瘤等多種作用[17-18]。姜黃素對(duì)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均有明顯抑制效果，具有多靶向的抗腫瘤作用，能夠直接或間接地保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受有害因素的損害，維持細(xì)胞正常的新陳代謝和生理功能，從而實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用，由于其活性廣泛，安全有效，因此極具臨床開發(fā)前景[19]。目前普遍認(rèn)為，姜黃素的抑瘤作用機(jī)制主要與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，它是通過調(diào)控抑癌基因、癌基因及其蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)等途徑實(shí)現(xiàn)的[20]。本研究的目的旨在討論姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的影響。PC-3細(xì)胞來源于人前列腺癌上皮，具有低轉(zhuǎn)移能力，在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展方面起到很重要的作用，如細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、黏附、遷移、細(xì)胞外周的蛋白水解作用，是良好的實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞株[21]。故本研究采用TUNEL法檢測(cè)PC-3細(xì)胞的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素可以誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。同時(shí)，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，姜黃素可以抑制HSP27 mRNA的表達(dá)，而且隨著劑量增加，抑制作用增強(qiáng)，具有劑量依賴性。

綜上所述，根據(jù)HSP27在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，可以判斷其惡性程度，為臨床制定治療方案和判斷預(yù)后提供了重要參考指標(biāo)；姜黃素可以抑制前列腺癌細(xì)胞表達(dá)HSP27 mRNA，高濃度的姜黃素抑制作用更強(qiáng)。姜黃素抑制PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)和誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，可能是其抗前列腺癌的機(jī)制之一，然而姜黃素誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制有待深入研究。

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Effect of Curcumin on Prostate Cancer PC-3Cell HSP27mRNA Expression and Apoptosis

XU Lei*，LIU Gang，LIU Chaoxuan

(Department of Orthopedic Surgery，The First People’s Hospital of Mudanjiang，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China)

Objective：To observe the effect of curcumin on prostate cancer PC-3 cell heat shock protein 27 (HSP27) expression and apoptosis，and discuss therapeutic mechanism of curcumin.Methods：RT-PCR of the HSP27 mRNA was implemented by the culture of RWPE-1，LNCaP，PC-3，and DU145 cell lines.Analysis was separately conducted in the control group，control vector group treated by dimethyl sulfoxide，and groups treated with 50 μmol·L-1or 25 μmol·L-12 μL curcumin.TUNEL staining，a way to evaluate PC-3 Cell apoptosis，and the expression of HSP27 mRNA in RT-PCR was observed.Results：Expression of LNCaP，PC-3 and DU145 HSP27 mRNA cells were significantly increased，compared with RWPE-1 cells，the difference was statistically significant (P<0.05).After curcumin treatment，the number of PC-3 Cell apoptosis detected by TUNEL was stronger at a 50 μmol·L-1curcumin concentration compared to that at a 25 μmol·L-1concentration，compared with the control group，the difference was statistically significant (P<0.05)，and the HSP27 mRNAexpression detected by RT-PCR was stronger at a 50 μmol·L-1curcumin concentration compared to that at a 25 μmol·L-1concentration，compared with the control group，the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion：Curcumin induces apoptosis in PC-3 and inhibits HSP27 mRNA expression may be one mechanism of its anti-prostate cancer.

Prostate cancer；curcumin；PC-3 cell；heat shock protein 27；cell apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.011

2014-08-15)

*

徐雷，主治醫(yī)師，研究方向：前列腺癌發(fā)生機(jī)制及生物學(xué)研究；E-mail：leixu1978@126.com