張文娟，尚柯，魏鋒*，馬雙成*

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 610045)

·基礎(chǔ)研究·

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法對太白貝母鑒別檢驗(yàn)的適用性探討△

張文娟1，尚柯2，魏鋒1*，馬雙成1*

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 610045)

目的：探討聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法(PCR-RFLP)對于太白貝母的適用性。方法：采集太白貝母野生及栽培品，收集市場上太白貝母偽品，利用性狀、PCR-RFLP鑒別法、DNA序列分析三種方法分析太白貝母與常見偽品的區(qū)別。結(jié)果：從性狀上看，太白貝母栽培品與偽品往往非常相似，較難辨別；通過PCR-RFLP方法可以正確、客觀的鑒別太白貝母與常見偽品，基于ITS2 的DNA條形碼方法進(jìn)一步驗(yàn)證了PCR-RFLP法的準(zhǔn)確性。市場上太白貝母的偽品多為伊犁貝母。結(jié)論：PCR-RFLP鑒別法可準(zhǔn)確鑒別太白貝母與其偽品；市場上太白貝母偽品較多，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管。

太白貝母；伊犁貝母；鑒別；性狀；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法(PCR-RFLP)；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)

太白貝母FritillariataipaiensisP. Y. Li為百合科貝母屬多年生草本植物，其干燥的鱗莖作為藥用。根據(jù)《城口廳志》記載，早在清道光二十三年 (公元1843 年) 城口就有貝母藥用[1]?！吨腥A人民共和國藥典》 2010 版將太白貝母作為川貝母的原植物收載[2]，這給太白貝母資源的開發(fā)帶來了機(jī)遇，同時(shí)也給太白貝母野生資源的保護(hù)帶來了新的挑戰(zhàn)，增加了緊迫感。

野生太白貝母資源主要分布在大巴山、巫山及武陵山海拔1860～2500 m 的山坡草叢或灌木叢中，資源稀少，呈帶狀或片塊狀分布。太白貝母又稱尖貝、川東貝母，主產(chǎn)重慶市巫溪、城口和陜西太白縣，具有引種栽培適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，為目前川貝母中最易栽培的品種之一，目前市場上的太白貝母以栽培品為主[3-4]。

太白貝母栽培品的出現(xiàn)也帶來了新的問題。有些栽培品與市場上川貝母的常見偽品(如伊貝母)相比，在外觀上非常相似，給鑒別檢驗(yàn)帶來了一定的困難。《中華人民共和國藥典》 2010 版 第一增補(bǔ)本中，收錄了基于ITS序列的川貝母PCR-RFLP鑒別法[5]。ITS(internal transcribed spacer)是核糖體RNA基因的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，包括ITS1和ITS2兩個(gè)部分。該區(qū)域在物種內(nèi)差異不大，然而種間差異較明顯，因而非常適用于植物分類學(xué)研究和中藥材的基原鑒定[6，7]。PCR-RFLP鑒別法即在PCR 的基礎(chǔ)上，對特異片段進(jìn)行切割，如果酶切位點(diǎn)發(fā)生了突變，便不能被切割；片段是否被切割可以通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測。由于川貝母基因組rDNA的ITS1區(qū)段存在限制性內(nèi)切酶SmaI的識別位點(diǎn)，而貝母屬其他品種在該區(qū)域沒有這一位點(diǎn)，因此可以用這種方法區(qū)別川貝母和其他貝母[8]。

該方法從DNA角度對樣品進(jìn)行分析鑒別，不受外觀變異的影響，也不易被藥材取樣部位、放置時(shí)間等因素干擾，結(jié)果客觀、穩(wěn)定、準(zhǔn)確。川貝母基原多樣、外觀多變，一直以來其真?zhèn)舞b別是個(gè)難點(diǎn)問題，而該方法的出現(xiàn)無疑為解決這一難題提供了強(qiáng)有力的武器。檢驗(yàn)人員在用該方法檢驗(yàn)“太白貝母”樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)較多批次不合格，其中多為栽培品。這些被判為了不合格的“太白貝母”本來就是偽品，還是發(fā)生了栽培變異，從而導(dǎo)致該方法不適合太白貝母栽培品的檢驗(yàn)？為了揭開這一疑問，我們收集了太白貝母野生品和栽培品，以及市場上太白貝母的樣品，對這些樣品進(jìn)行性狀、PCR-RFLP以及DNA條形碼分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正品太白貝母具有符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的性狀特征，PCR-RFLP法檢驗(yàn)亦符合藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，PCR-RFLP法檢驗(yàn)判定為不合格的太白貝母樣品，用基于ITS2的DNA條形碼方法進(jìn)一步得到了驗(yàn)證。我們的研究結(jié)果提示，PCR-RFLP法適用于太白貝母的鑒別檢驗(yàn)；市場上太白貝母偽品較多，以伊貝母最為常見。本研究肯定了PCR-RFLP法在太白貝母鑒別中的適用性，在一定程度上揭示了太白貝母的市場狀況，為其市場監(jiān)控檢驗(yàn)提供了理論和技術(shù)指導(dǎo)。

1 儀器材料與方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 儀器

PCR儀(ABI VERITI)，分析天平(Mettler AB135-S)，純水儀(Millipore公司)，電泳儀(EPS-301，Amersham)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(SyngeneGeneGenius)，球磨儀(M400，Retsch)，微量紫外分光光度計(jì)，水浴鍋。

1.1.2 試劑

快捷型植物基因組提取試劑盒(DP321，天根生化科技有限公司)，Ex Taq(DRR100B，TaKaRa)，dNTP Mixture 10 mM(N0447，New England Biolabs)，Sma I(R0141，New England Biolabs) GelRed(41003，Biotium)，瓊脂糖(BLOWEST)，GelRed(Biotium)，Tris堿，冰醋酸，EDTANa22H2O(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，引物(華大基因)上游：5‘-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’下游：5‘-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’，用于測序的引物(華大基因)上游：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3’，下游：5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC -3’。

1.2 方法

1.2.1 樣品來源 本實(shí)驗(yàn)所用太白貝母野生品為野外采集并經(jīng)過相關(guān)專家確認(rèn)，栽培品部分采自栽培基地，部分為廠家送樣。

1.2.2 樣品處理 取太白貝母樣品一粒，用酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛簦栏?；用球磨儀磨成極細(xì)粉末，稱取粉末樣品約30 mg備用。

1.2.3 DNA提取和定量分析 按照基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA定量。

1.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)條件

預(yù)變性94 ℃ 5 min

反應(yīng)循環(huán)(35輪) 94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s

最后延伸 72 ℃ 5 min

1.2.5 SmaI酶切反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μL——取PCR產(chǎn)物10 μL，加入SmaI 0.5 μL，反應(yīng)緩沖液2 μL，高壓蒸汽滅菌的去離子水7.5 μL。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像：使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓5V/cm，約40 min；之后使用紫外凝膠成像儀拍照并保存結(jié)果。1.2.7 序列測定：PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；反應(yīng)循環(huán)(35輪)94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后延伸 72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板1 μL，上下游引物各0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dNTP(10 mM)0.6 μL，反應(yīng)緩沖液2.5 μL，高壓蒸汽滅菌的去離子水(ddH2O)20.3 μL[5]。PCR樣品送華大基因完成測序。

1.2.8 序列分析：用Codoncode Aligner 4.06(Codoncode Co.，USA)軟件進(jìn)行序列拼接及校對，去除序列兩端的低質(zhì)量部分。利用ITS2數(shù)據(jù)庫(http：//its2-old2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg. de/cgi-bin/index.)，去除序列兩端5.8S和28S區(qū)域，獲得完整的ITS2序列。用MEGA5.0軟件，對不同樣品的ITS2序列進(jìn)行比對(Clustal W)及變異位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 性狀特征

收集野生太白貝母樣品10批，太白貝母栽培品10批及以太白貝母送檢的樣品6批。野生樣品由中國食品藥品檢定研究院張南平老師鑒定。

野生太白貝母以青貝多見，即類扁球形，鱗葉大小懸殊，大瓣與小瓣抱合不緊；頂部閉合，先端尖；小瓣中下部近等寬，先端漸尖；大瓣基部明顯隘縮狀。高0.4～1.0 cm，直徑0.6～1.1 cm，呈黃白色，表面較粗糙，有褐色斑點(diǎn)，氣微，略苦。

太白貝母栽培品在性狀上變異較大，呈類長圓柱形，鱗葉大小懸殊，抱合緊密；頂部閉合，先端鈍圓，基部明顯隘縮狀。高0.7～1.8 cm，直徑0.9～1.6 cm。表面及氣味特征似野生品種。

以“太白貝母”送檢的6批樣品，多呈類圓錐或圓柱形，外層鱗葉兩瓣，肥大，一片較大或近等大，抱合。頂端稍尖，少有開裂，基部微凹陷。與野生太白貝母及其栽培品相比，個(gè)頭較大，一般高1.5～2.0 cm，直徑1.0～1.5 cm。表面及氣味特征與野生和栽培太白貝母無明顯差異(圖1，表1)。

A 太白貝母(野生)；B 太白貝母(栽培)；C和D：太白貝母偽品(伊貝母)圖1 太白貝母及偽品伊貝母

樣品名稱形狀大小色澤表面氣味太白貝母(野生)呈類扁圓錐形,鱗葉大小懸殊,大瓣與小瓣抱合不緊;頂部閉合,先端尖;小瓣中下部近等寬,先端漸尖;大瓣基部明顯隘縮狀高0.4～1.0cm,直徑0.6～1.1cm黃白色較粗糙,有褐色斑點(diǎn)氣微,味微苦太白貝母(栽培)呈類長圓柱形,鱗葉大小懸殊,抱合緊密;頂部閉合,先端鈍圓,基部明顯隘縮狀高0.7～1.8cm,直徑0.9～1.6cm黃白色較粗糙,有褐色斑點(diǎn)氣微,味微苦偽品(伊貝母)呈類圓柱形,外層鱗葉兩瓣,肥大,一片較大或近等大,抱合。頂端稍尖,少有開裂,基部微凹陷。高1.5～2.0cm,直徑1.0～1.5cm黃白色較粗糙,有褐色斑點(diǎn)氣微,味微苦

2.2 PCR-RFLP結(jié)果

按照《中華人民共和國藥典》2010版第一增補(bǔ)本 川貝母項(xiàng)下的PCR-RFLP鑒別法，我們對這些太白貝母樣品進(jìn)行了檢測。所有野生太白貝母樣品的PCR產(chǎn)物都能夠被限制性內(nèi)切酶Sma I切成兩個(gè)片段，大小位于100～250bp，即符合《中華人民共和國藥典》的相關(guān)規(guī)定。太白貝母栽培品10批中有8批也得到相同的結(jié)果；另有2份栽培品，其PCR產(chǎn)物不能被 Sma I 酶切，即不符合《中華人民共和國藥典》的相關(guān)規(guī)定(圖2，3，4)。所有標(biāo)為“太白貝母”的待檢樣品，其PCR產(chǎn)物均不能被 Sma I 酶切。DNA測序結(jié)果提示，這些不符合《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定的“太白貝母”樣品實(shí)際為伊犁貝母。

a：PCR產(chǎn)物；b：PCR產(chǎn)物被SmaI酶切后；1-6：太白貝母(野生)；M：DNA分子量標(biāo)記；B：空白對照；P：陽性對照圖2 太白貝母(野生)的PCR-RFLP結(jié)果

1-4：太白貝母(栽培)；M：DNA分子量標(biāo)記；B：空白對照；P：陽性對照圖3 太白貝母(栽培)的PCR-RFLP結(jié)果

a：PCR產(chǎn)物；b：PCR產(chǎn)物被 SmaI酶切后；1-6：太白貝母檢品 M：DNA分子量標(biāo)記；B：空白對照；P：陽性對照圖4 太白貝母檢品的PCR-RFLP結(jié)果

2.3 以ITS2作為分子標(biāo)記的DNA條形碼和序列分析

我們選擇被PCR-RFLP鑒定法判定為不符合規(guī)定的樣品及部分正品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到樣品DNA的ITS2區(qū)段，BLAST檢索NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫，得到樣品的基原信息，用以佐證PCR-RFLP的結(jié)果。被PCR-RFLP方法判定為合格的樣品，確實(shí)為太白貝母；而判定為不合格的太白貝母樣品，DNA條形碼方法的分析結(jié)果為伊犁貝母(表2)。即兩種方法的結(jié)果是一致的，說明PCR-RFLP法可以用于太白貝母的檢驗(yàn)。

進(jìn)一步對樣品DNA的ITS2 序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)太白貝母的ITS2為238bp，伊犁貝母為239bp，二者之間共存在12處變異，其中伊犁貝母在ITS2序列的第34位插入了一個(gè)“G”，因此總長度比太白貝母多一個(gè)堿基(圖5)。

3 討論

按照《中華人民共和國藥典》2010版第一增補(bǔ)本的規(guī)定，太白貝母被作為川貝母來源之一[5]。因其引種栽培適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高，故市場上的太白貝母以栽培品多見[3-4]。然而栽培品性狀變異較大，與其它貝母屬植物來源的貝母(如伊犁貝母)相似度較高，因此僅依靠性狀鑒別往往難以得出真?zhèn)闻c否的結(jié)論。PCR-RFLP鑒別法與僅憑肉眼觀察的形狀鑒別法相比，客觀，準(zhǔn)確，很好的解決了這一難題[5]。然而，利用該方法對市場上的太白貝母進(jìn)行檢驗(yàn)之后，發(fā)現(xiàn)很少有合格產(chǎn)品。面對這種情況，檢驗(yàn)人員不禁產(chǎn)生了疑慮：究竟是市場上太白貝母偽品多，還是該P(yáng)CR-RFLP鑒別法不適用呢？本研究通過對基原明確的太白貝母樣品以及檢品，同時(shí)進(jìn)行性狀、PCR-RFLP和DNA條形碼的分析，明確了正品太白貝母，無論野生還是栽培品，均應(yīng)符合《中華人民共和國藥典》2010版第一增補(bǔ)本川貝母項(xiàng)下PCR-RFLP鑒別法的規(guī)定進(jìn)行測序的樣品中，有2批(符合和不符合PCR-RFLP鑒別法規(guī)定的各有1批)樣品測序結(jié)果因嚴(yán)重套峰而導(dǎo)致測序失敗。溯源樣品發(fā)現(xiàn)這兩批樣品真菌污染非常嚴(yán)重，可能PCR產(chǎn)物中存在真菌ITS的污染，從而導(dǎo)致測序套峰的出現(xiàn)。盡管我們盡可能去除真菌污染部分之后，重復(fù)試驗(yàn)并再次送樣測序，仍然是嚴(yán)重套峰的結(jié)果。ITS存在多拷貝現(xiàn)象[9]，也可導(dǎo)致套峰的出現(xiàn)。究竟是因?yàn)檎婢廴具€是ITS多拷貝，目前尚不清楚。

表2 樣品信息及對應(yīng)的PCR-RFLP、DNA條形碼鑒定結(jié)果

圖5 太白貝母與常見混偽品伊犁貝母的序列比對分析

在本研究中，DNA條形碼技術(shù)作為對PCR-RFLP結(jié)果的驗(yàn)證方法，起到了關(guān)鍵性作用。由于可以精確知曉待鑒定藥材的基因序列，DNA條形碼的方法較之其他的DNA分子鑒別法，其結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。因此，當(dāng)我們在實(shí)際工作中遇到用其他方法難以鑒別的中藥材時(shí)，可采用該方法予以檢驗(yàn)，從而得到比較確定的結(jié)論。目前，中藥材DNA條形碼方面的應(yīng)用研究已有較大進(jìn)展：對于現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》收錄的絕大多數(shù)中藥材品種，已獲得其準(zhǔn)確的DNA條形碼序列；并且，在此基礎(chǔ)上，將二維碼技術(shù)與DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合，為每個(gè)藥材基原物種提供標(biāo)準(zhǔn)二維DNA條形碼，有利于DNA條形碼信息在不同平臺間轉(zhuǎn)換，為二維DNA條形碼技術(shù)在實(shí)際流通監(jiān)管工作中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，能有效實(shí)現(xiàn)對中藥材流通的數(shù)字化監(jiān)管，推動(dòng)中藥材流通監(jiān)管現(xiàn)代化、國際化進(jìn)程。這些研究成果為DNA條形碼在中藥材鑒定中的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。由陳士林教授課題組起草的“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則”已收錄入《中華人民共和國藥典》，表明該技術(shù)面向應(yīng)用邁出了堅(jiān)實(shí)的一步，未來的應(yīng)用前景十分廣闊[10-13]。本研究結(jié)果提示，市場上太白貝母偽品較多，需加強(qiáng)監(jiān)管力度。在未來，如果二維DNA條形碼技術(shù)得到推廣應(yīng)用，相信類似貝母這樣基原復(fù)雜中藥材的市場亂象將得到很好控制。

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Applicability of PCR-restriction Fragment Length Polymorphism Method in Identification of Fritillaria taipaiensis Bulbus

ZHANG Wenjuan1，SHANG Ke2，WEI Feng1*，MA Shuangcheng1*

(1.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China；2.Chengdu Institutes for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China)

Objective：To explore the applicability of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) on identification of Fritillaria taipaiensis Bulbus.Methods：The samples of wild and cultivatedF.taipaiensisand the samples from the market were colleeted, and they were identified from the common adulterants adulterants based on characteristics，PCR-RFLP，and DNA sequence analysis.Results：It was difficult to identifyF.taipaiensisfrom its adulterants by characteristics as they showed similar appearance. With the method of PCR-RFLPF.taipaiensiswas accurately and objectively identified，which was further verified by DNA barcoding based on ITS2. On the market，most of the adulterants ofF.taipaiensiswereF.pallidiflora.Conclusion：The method of PCR-RFLP could be successfully applied in the identification ofF.taipaiensis. The adulterants ofF.taipaiensison the market are so common that its quality control needs to be strengthened.

Fritillariataipaiensis；F.pallidiflora；identification；characteristics；polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)；internal transcribed spacer (ITS)

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.006

2015-08-03)

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31200673)；重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項(xiàng)(2014ZX0930437001，2014ZX0930437002)

*

馬雙成，博士，研究員，研究方向：中藥材檢驗(yàn)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；Tel：(010)67095272，E-mail：masc@nifdc.org.cn 魏鋒，博士，研究員，研究方向：中藥材檢驗(yàn)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；Tel：(010)67095432，E-mail：weifeng@nifdc.org.cn