孫琛，張健，王征，宋忠興，劉紅波，謝培，唐志書*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 712083；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046)

·基礎(chǔ)研究·

翻白草總黃酮及翻白草復(fù)方的降血糖作用研究△

孫琛1，張健1，王征1，宋忠興2，劉紅波2，謝培1，唐志書1*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 712083；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046)

目的：研究翻白草總黃酮和從民間收集的復(fù)方(翻白草30 g、地骨皮50 g、桑葉10 g)對(duì)高血糖小鼠的降血糖作用。方法：選擇昆明種小鼠，采用四氧嘧啶(50 mg·kg-1)腹腔注射造模，將造模成功的小鼠(血糖≥11.1 mmol·L-1以上)隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組、消渴丸組、翻白草總黃酮大劑量組(320 mg·kg-1)、翻白草總黃酮中劑量組(160 mg·kg-1)、翻白草總黃酮小劑量組(80 mg·kg-1)、復(fù)方大劑量組(10 g生藥·kg-1)、復(fù)方中劑量組(5g生藥·kg-1)、復(fù)方小劑量組(2.5 g生藥·kg-1)。連續(xù)給藥14 d后，觀察翻白草總黃酮及翻白草復(fù)方對(duì)高血糖小鼠體重、血糖、胰島素敏感指數(shù)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)的影響。結(jié)果：翻白草總黃酮大、中、小劑量及復(fù)方大、中、小劑量可以明顯降低高血糖小鼠的血糖值，提高小鼠胰島素敏感指數(shù)，升高小鼠體內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活力。結(jié)論：翻白草總黃酮及其復(fù)方可以顯著提高小鼠的抗氧化能力，降低胰島素抵抗力，并且復(fù)方各組對(duì)小鼠的降血糖作用強(qiáng)于翻白草總黃酮各組。

翻白草總黃酮；復(fù)方；降血糖作用

近年來(lái)，世界各國(guó)糖尿病的患病率顯著增加，大約90%的糖尿病患者為2型糖尿病。近30到50年仍然很難緩解糖尿病的急劇增加，世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在1994年有1.2億例糖尿病患者，1997年達(dá)到1.35億，2000年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)為1.75億，到2010年已經(jīng)有2.39億例糖尿病患者，預(yù)測(cè)在2025年將會(huì)有超過(guò)3億的糖尿病患者。糖尿病患者最多的3個(gè)國(guó)家分別為印度、中國(guó)以及美國(guó)。此外，2型糖尿病還會(huì)導(dǎo)致許多并發(fā)癥，如：心臟方面的病變、腎功能衰竭、腦血管疾病、失明以及肢體壞疽等[1-2]。研究表明，高血糖是引發(fā)這些糖尿病并發(fā)癥的主要原因。因此對(duì)糖尿病進(jìn)行控制及有效治療的最重要的策略便是降低并控制血糖在正常的水平。臨床一般采用的是雙胍類、胰島素、磺脲類藥物來(lái)降低血糖。這些藥物的降糖作用雖然比較明顯，但是也存在著較多的副作用，采用中藥治療糖尿病療效確切、前景良好、副作用小。

翻白草PotentilladiscolorBge.為薔薇科(Rosaceae)植物，味甘、微苦，性平，無(wú)毒，歸肝、胃、大腸經(jīng)[3]。翻白草于《救荒本草》中首次提到，分布在全國(guó)各地，全草都可以入藥，民間有記載翻白草可以降低血糖治療2型糖尿病，其降血糖的主要活性成分為翻白草中的黃酮類物質(zhì)[4-5]。另外，我們從民間收集了可降低血糖的含有翻白草的復(fù)方，具體復(fù)方組成為：翻白草30 g、地骨皮50 g、桑葉10 g。目前針對(duì)翻白草的藥理學(xué)研究大多都和治療糖尿病有關(guān)，有研究人員發(fā)現(xiàn)翻白草具有降血糖作用，其中主要有效成分為翻白草中黃酮類化合物，但是沒(méi)有更深一步地研究它的作用機(jī)理和具體的藥理作用。所以在現(xiàn)今研究中對(duì)于翻白草降血糖作用的研究大多針對(duì)其總黃酮成分，對(duì)于含有翻白草復(fù)方的研究仍是空白，本文主要針對(duì)翻白草總黃酮和從民間收集的復(fù)方的降血糖作用進(jìn)行研究。

1 材料與儀器、動(dòng)物

1.1 材料

翻白草購(gòu)自陜西省藥材市場(chǎng)，由西北大學(xué)王亞洲副教授鑒定為翻白草PotentilladiscolorBge.全草。

取干燥全草，粉碎，過(guò)篩，在70 ℃用70%乙醇連續(xù)回流提取2次，每次2 h，減壓回收提取溶劑，用石油醚提取葉綠素，除去石油醚層，再選用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯層，將乙酸乙酯層濃縮回收至浸膏狀，即得翻白草總黃酮粗品(得膏率為1.1%)，實(shí)驗(yàn)中配成大(320 mg·kg-1)、中(160 mg·kg-1)、小(80 mg·kg-1)劑量的混懸液，以翻白草質(zhì)量計(jì)為大(29.1 g生藥·kg-1)、中(14.5 g生藥·kg-1)、小(7.27 g生藥·kg-1)劑量。

取干燥全草，粉碎后過(guò)篩，用70%的乙醇連續(xù)回流提取2次，所得提取液減壓回收至干，再加水，得翻白草醇提取液(1 g生藥·mL-1)。

取全草，粉碎后過(guò)篩，用水連續(xù)回流提取2次，所得提取液減壓回收得翻白草水提取液(1 g生藥·mL-1)。

翻白草復(fù)方：翻白草30 g、地骨皮50 g、桑葉10 g。取復(fù)方水煎2次，每次1 h，合并2次水煎液。實(shí)驗(yàn)中均以翻白草質(zhì)量計(jì)配成大(10 g生藥·kg-1)、中(5 g生藥·kg-1)、小(2.5 g生藥·kg-1)劑量的混懸液。

1.2 試藥

消渴靈片(吉林省康福藥業(yè)有限公司)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司)；四氧嘧啶(SIGMA公司)；0.9%氯化鈉溶液(河南華利藥業(yè)有限責(zé)任公司)；INS(胰島素)藥盒(北京華英生物技術(shù)研究所)；GSH-PX(谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；CAT(過(guò)氧化氫酶)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器

分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；EYALAN-N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本RIKAKIKAI公司)；血糖測(cè)試儀(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司)；血糖試紙條(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司)；U-2001紫外-可見分光光度計(jì)(日本HITAICHI公司)；R-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀。

1.4 動(dòng)物與飼養(yǎng)條件

昆明種雄性小鼠120只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2012-0009)，體重：18～25 g。飼養(yǎng)條件：SPF實(shí)驗(yàn)室，相對(duì)濕度：30%～40%，溫度：20～30 ℃，SPF級(jí)飼料(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，純凈水，保持各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件一致。

2 方法

2.1 小鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)

取昆明種雄性小鼠30只，體重18～25 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、翻白草醇提液組(10 g生藥·kg-1)、翻白草總黃酮組(320 mg·kg-1)、翻白草水提液組(10 g生藥·kg-1)、復(fù)方組(10 g生藥·kg-1，以翻白草計(jì))，每組6只，對(duì)各組小鼠禁食不禁水，在12 h后尾靜脈取血測(cè)小鼠的空腹血糖，再對(duì)各組小鼠灌胃給藥，空白對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液，記錄給藥后的時(shí)間，并于給藥后1、2、3、5、24 h尾靜脈取血測(cè)定小鼠的空腹血糖。

2.2 建立高血糖模型

取昆明種雄性小白鼠，90只，體重18～25 g。在SPF實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為10組，每組9只，即空白對(duì)照組(C)、模型組(M)、二甲雙胍組(G)、消渴丸組(X)、翻白草總黃酮小劑量組(H1)、翻白草總黃酮中劑量組(H2)、翻白草總黃酮大劑量組(H3)、復(fù)方小劑量組(F1)、復(fù)方中劑量組(F2)、復(fù)方大劑量組(F3)?？瞻讓?duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，飲用蒸餾水，其余各組每天灌服高濃度的葡萄糖30 g·kg-1，同時(shí)飲用5%葡萄糖水，連續(xù)灌服20 d，分別于實(shí)驗(yàn)第1、2、3、5、10、14天腹腔注射四氧嘧啶0.9%氯化鈉溶液50 mg·kg-1。第20天眼眶取血，測(cè)空腹血糖，血糖濃度達(dá)11.1 mmol·L-1以上者選用，各組和空白對(duì)照組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 給藥方法

空白對(duì)照組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液0.1 mL·(10 g)-1，二甲雙胍組(125 mg·kg-1)、消渴丸組(2.88 g·kg-1)、翻白草總黃酮大劑量組(320 mg·kg-1)、翻白草總黃酮中劑量組(160 mg·kg-1)、翻白草總黃酮小劑量組(80 mg·kg-1)、復(fù)方大劑量組(10 g生藥·kg-1，以翻白草計(jì))、復(fù)方中劑量組(5 g生藥·kg-1，以翻白草計(jì))、復(fù)方小劑量組(2.5 g生藥·kg-1，以翻白草計(jì))對(duì)高血糖小鼠灌胃給藥，14 d后禁食，第15天早上空腹給藥，給藥后1 h眼眶取血，取血量為1～1.5 mL，靜置，用離心機(jī)離心(3000 r·min-1)10 min，迅速分離血清，取血清50 μL，測(cè)血糖、血清胰島素、CAT和GSH-PX值。

2.4 檢測(cè)方法

采用125I胰島素放射免疫分析試劑盒測(cè)定各組小鼠血清的空腹血清胰島素水平，采用CAT試劑盒測(cè)定各組小鼠的過(guò)氧化氫酶活力，采用GSH-PX測(cè)試盒測(cè)其血清中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包處理，各組比較用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，翻白草總黃酮和復(fù)方均可以降低正常小鼠的血糖值，其中翻白草總黃酮能夠快速降低小鼠的血糖值，而復(fù)方組降血糖作用較緩慢，但是復(fù)方組其藥效維持時(shí)間比翻白草總黃酮組長(zhǎng)。翻白草水提液及醇提液不能降低正常小鼠的血糖值。

表1 小鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)血糖記錄結(jié)果

3.2 翻白草總黃酮及復(fù)方對(duì)高血糖小鼠的血糖影響

如圖1所示，各給藥組小鼠的血糖值均有下降，其中翻白草總黃酮中劑量、復(fù)方中劑量、二甲雙胍、消渴丸組下降最為顯著，其余各給藥組血糖下降均達(dá)到正常水平，模型組小鼠血糖仍高于正常水平。各給藥組血糖與模型組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(***P<0.001)。復(fù)方各組降血糖效果比翻白草總黃酮各組效果顯著。

3.3 各組胰島素敏感指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

胰島素敏感指數(shù)(INS)計(jì)算公式：

INS=Ln[1/(胰島素值×空腹血糖值)]

如圖2所示，模型組胰島素敏感指數(shù)明顯下降，各給藥組胰島素敏感指數(shù)升高，與模型組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，翻白草總黃酮中劑量和復(fù)方小劑量效果最佳，復(fù)方各組比翻白草總黃酮各組提高胰島素敏感指數(shù)效果顯著。

注：與模型組相比，***P<0.001。圖1 各組小鼠給藥前后血糖值比較

注：與模型組相比，*P<0.05。圖2 各組小鼠胰島素敏感指數(shù)比較

3.4 各組小鼠CAT活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖3所示，各給藥組CAT值和模型組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，各給藥組和對(duì)照組相比CAT值均達(dá)到正常水平，翻白草總黃酮小劑量、復(fù)方大劑量、二甲雙胍及消渴丸效果最為顯著。

注：與模型組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖3 各組小鼠CAT值比較

3.5 各組GSH-Px活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，各給藥組GSH-Px均有明顯提高，其中總黃酮小劑量效果較顯著(P<0.05)，消渴丸效果最顯著(P<0.01)，總黃酮小劑量組和消渴丸組GSH-Px值恢復(fù)正常水平。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組小鼠GSH-Px值比較

4 討論

本實(shí)驗(yàn)的造模原理為動(dòng)物在飲用高葡萄糖基礎(chǔ)上，加小劑量四氧嘧啶，使小鼠血糖升高。在整個(gè)造模過(guò)程中需要注意以下幾點(diǎn)：四氧嘧啶應(yīng)于臨用前配制，并盛裝于棕色瓶中于2 h內(nèi)用完，其原因是由于四氧嘧啶的水溶液很不穩(wěn)定，易分解成四氧嘧啶酸而失效。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性小白鼠，是由于雄性小鼠對(duì)于外界的刺激很敏感，即對(duì)藥物敏感性較強(qiáng)。由于高濃度還原性物質(zhì)(例如：維生素C)會(huì)通過(guò)色素原競(jìng)爭(zhēng)游離的氧，使反應(yīng)受到干擾而使結(jié)果偏低，血紅蛋白也會(huì)引起過(guò)氧化氫分解使測(cè)定結(jié)果偏低，故取血后盡快分離血清，并盡早測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)先對(duì)小鼠進(jìn)行高血糖造模，高血糖會(huì)引發(fā)多種癥狀，如：多尿、口渴多飲、疲勞、體重減輕、多食。在整個(gè)造模過(guò)程中，為了確保成功造模，我們需要細(xì)心觀察小鼠是否出現(xiàn)上述癥狀。小鼠尿量增多，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確需要每天更換小鼠墊料，確保小鼠的生活環(huán)境干凈健康。文獻(xiàn)[6-7]認(rèn)為應(yīng)當(dāng)在第1、2、14天對(duì)小鼠腹腔注射四氧嘧啶，但是造模成功率較低，我們將其更改為第1、2、3、5、10、14天腹腔注射四氧嘧啶使造模成功率達(dá)到85%以上。

取造模成功的小鼠(血糖值高于11.1 mmol·L-1)，進(jìn)行灌胃給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥組各劑量沒(méi)有呈現(xiàn)良好量效關(guān)系，對(duì)于其劑量的選取今后將會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行研究。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)降低小鼠胰島素抵抗作用即是提高小鼠胰島素敏感指數(shù)[8]，從而降低血糖，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)翻白草總黃酮可以提高小鼠胰島素敏感指數(shù)，這可能是其降血糖的機(jī)制。2型糖尿病的發(fā)病原因之一就是胰島素抵抗力增強(qiáng)，翻白草可降低胰島素抵抗力，對(duì)治療2型糖尿病具有良好前景。

小鼠血清中的CAT及GSH-Px酶活力可以說(shuō)明抗氧化作用[9]，由測(cè)定結(jié)果可知翻白草總黃酮及復(fù)方均可明顯提高小鼠的CAT值及GSH-Px值，從作用機(jī)理上看，降低小鼠的血糖和提高其抗氧化能力可能具有聯(lián)系。今后在針對(duì)降血糖作用的研究也可以從提高其氧化應(yīng)激方面著手，為進(jìn)一步研究降血糖作用開辟了新思路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明翻白草總黃酮及復(fù)方可以顯著降低高血糖小鼠的空腹血糖，提高胰島素敏感指數(shù)及過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力。從一定程度上驗(yàn)證了翻白草總黃酮及復(fù)方治療2型糖尿病的作用。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果量效關(guān)系表現(xiàn)不明顯，對(duì)于黃酮類成分會(huì)不會(huì)干擾血糖的測(cè)定，仍

需在以后的工作中進(jìn)一步探討。

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Studies on Hypoglycemic Effects of Total Flavonoids and Compound Prescription ContainingPotentilladiscolorBge.

SUN Chen1，ZHANG Jian1，WANG Zheng1，SONG Zhongxing2，LIU Hongbo2，XIE Pei1，TANG Zhishu1*

(1.Shaanxi University of Chinese Medicine/Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Xianyang 712083,China;2.Shaanxi province key laboratory of new drugs and Chinese medicine foundation research，Xianyang 712046,China)

Objective：To investigate the hypoglycemic effects of total flavonoids and compound prescription containingPotentilladiscolorBge. on hyperglycemia mice.Methods：Kunming micewere used as experiment animal，the model mice of alloxan-diabetes were randomly divided into these groups：control group，model group，metformin group，diabetes pill group，total flavonoids in high-dose group(320 mg·kg-1)，total flavonoids in middle-dose group(160 mg·kg-1)，total flavonoids in low-dose group(80 mg·kg-1)，compound in high-dose group(10 g herbs·kg-1)，compound in middle-dose group(5 g herbs·kg-1)，compound in low-dose group(2.5 g herbs·kg-1).Body weight，blood sugar，the insulin sensitivity index，catalase，and glutathion peroxidase in serum were measured after 14 days.Results：Total flavonoids and the compoundprescription could reduce the blood glucose of hyperglycemia mice，and significantly improve the insulin sensitivity index，and the mice of catalase (CAT) activity as well as glutathione peroxidase (GSH-Px) activity.Conclusion：Total flavonoids and the compound prescription could significantly increase the antioxidant activity and reduce insulin resistance of mice.The hypoglycemic effects of compound was better thanthat of total flavonoids.

Flavonoids ofPotentilladiscolorBge.；compoundprescription；hypoglycemic effects

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.009

2015-06-01)

*

唐志書，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥創(chuàng)新產(chǎn)品開發(fā)；Tel：(029)38182202，E-mail：tzs6565@163.com