董泰山，韓曉靜

(1.高平市新農(nóng)合管理中心，山西 晉城 048400；2.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031)

·基礎(chǔ)研究·

基于核磁共振的山藥與麩炒山藥化學(xué)成分比較

董泰山1，韓曉靜2*

(1.高平市新農(nóng)合管理中心，山西 晉城 048400；2.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031)

目的：比較山藥與麩炒山藥的化學(xué)組成差異，為其質(zhì)量控制提供研究依據(jù)。方法：采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)對山藥和麩炒山藥進行分析，通過聚類分析、主成分分析、遞歸支持向量機分析等多種多元統(tǒng)計方法闡明其化學(xué)差異成分。結(jié)果：山藥核磁共振指紋圖譜中共指認(rèn)出了代謝物23種，多元統(tǒng)計分析顯示不同批次的山藥之間差異較小，而不同批次的麩炒山藥組間差異較大，山藥中丙氨酸、谷氨酰胺及蘋果酸含量較高，麩炒山藥中異亮氨酸、亮氨酸、蔗糖、α-葡萄糖、γ-氨基丁酸、天冬酰胺、酪氨酸及苯丙氨酸含量較高。結(jié)論：本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)從多成分角度比較了山藥與麩炒山藥的差異，為山藥、麩炒山藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了依據(jù)。

山藥；麩炒山藥；植物代謝組學(xué)；NMR；多元統(tǒng)計

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖，屬多年生纏繞草本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。山藥飲片的歷代炮制方法有清炒、麩炒、土炒等，生山藥和麩炒山藥都是中醫(yī)臨床常用的品種。山藥具有補脾養(yǎng)胃，生津益肺，補腎澀精功能。用于脾虛食少，久瀉不止，肺虛喘咳，腎虛遺精，帶下，尿頻，虛熱消渴。麩炒山藥補脾健胃。用于脾虛食少，泄瀉便溏，白帶過多[1]。

化學(xué)成分研究表明，山藥中含有豐富的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、多種微量元素、多糖、尿囊素、淀粉酶、膽堿等多種成分，這些化學(xué)成分是山藥營養(yǎng)價值和功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。對于山藥在炮制后的化學(xué)成分變化，有學(xué)者使用薄層色譜、紫外光譜、高效液相色譜等方法對其進行比較，結(jié)果顯示其區(qū)別在于山藥麩炒后5-羥甲基糠醛、糠醛等成分含量升高[3]，而尿囊素有所升高或不變[4-5]。然而，山藥化學(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)有研究尚未從整體上反映出山藥與麩炒山藥的化學(xué)差異。

近年來基于核磁共振的植物代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成功用于多種中藥的質(zhì)量分析與評價[6]，如厚樸[7]、人參[8]、地黃[9]、遠志[10]等，為中藥質(zhì)量控制提供了一種有別于指紋圖譜的整體性分析方法。本研究采用基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)對山藥與麩炒山藥進行化學(xué)比較研究，從化學(xué)角度闡明山藥與麩炒山藥的差異，為山藥與麩炒山藥的質(zhì)量控制以及差異成分與功效的相關(guān)性研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Bruker 600-MHz AVANCE III NMR Spectrometer(600.13 MHz質(zhì)子頻率，德國布魯克公司600兆核磁儀)，超聲波清洗器(KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A，上海亞榮生化儀器廠)，SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，TGL-16高速臺式冷凍離心機。

NMR試劑：重水(Norell，Landisville，USA)，氘代甲醇(99.8%，Merck，Germany)，氘代氫氧化鈉(Armar，Switzerland)，3-三甲基硅基[2，2，3，3-d4]氘代丙酸鈉(TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc.，MA)。甲醇為分析純，娃哈哈純凈水。

1.2 材料

從山西省太原市長城藥店、榮華藥店、新河藥店中購買了4個不同批次的麩炒山藥和4個不同批次的山藥，共8個批次，每批樣品平行做兩次實驗(1～8號為麩炒山藥，9～16號為山藥)。山藥、麩炒山藥經(jīng)山西藥科職業(yè)學(xué)院韓曉靜講師鑒定，標(biāo)本保存在山西藥科職業(yè)學(xué)院。

2 方法

2.1 樣品制備

參照文獻報道方法進行供試品溶液制備[10]。精密稱取山藥、麩炒山藥樣品粉末200 mg 置于10 mL離心管中，分別加純凈水及甲醇各3 mL，漩渦混勻1 min，超聲提取25 min，離心(3500 r·min-1)25 min，然后用移液槍將澄清部分轉(zhuǎn)移至25 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮蒸干。于測定前用NMR試劑溶解，用氘代甲醇400 μL與緩沖重氫水(Buffer：KH2PO4溶于D2O中，以1 mol·L-1氘代氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，含0.1% TSP)400 μL溶解，離心(13 000 r·min-1)10 min，移取上清液600 μL于5 mm核磁管中待測。

2.21H-NMR測定

樣品在25 ℃下于600 MHz NMR儀上測定，測定頻率為600.13 MHz，掃描次數(shù)為64，譜寬12 345.7 Hz，傅里葉變換0.188 Hz，脈沖間隔D1為1 s，延遲時間為5.0 s，相調(diào)節(jié)、基線調(diào)節(jié)及峰校正均為手動。樣本提取物核磁測定采用noesyppr1d序列壓制水峰，用氘代甲醇進行鎖場，內(nèi)標(biāo)為TSP。

2.3 數(shù)據(jù)分析

核磁圖譜采用MestReNova軟件(version 8.0.1，Mestrelab Research，Santiago de Compostella，西班牙)進行處理。對圖譜的相位、基線及平滑進行校正并實現(xiàn)位移的定標(biāo)后，以δ0.04積分段對化學(xué)位移區(qū)間δ0.77 ～9.49進行分段積分。核磁圖譜中δ4.78～5.14(殘余水峰)和δ3.29～3.33(殘余甲醇峰)不進行積分。將積分后的數(shù)據(jù)保存至Excel表中，進行后續(xù)分析。

將Excel表中的積分?jǐn)?shù)據(jù)先導(dǎo)入SPSS 16.0軟件中進行HCA聚類分析，不同類間距離的測量方法使用Between-groups法、距離種類使用Block。然后將其導(dǎo)入SIMCA-P13.0(Umetrics，Umea，Sweden)軟件中進行主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)。此外，利用代謝組學(xué)分析網(wǎng)站(hppt：//www.metaboanalyst.ca)進行遞歸支持向量機分析(R-SVM)。根據(jù)分析結(jié)果，找出差異性代謝產(chǎn)物，對其相對峰面積進行t檢驗，以尋找顯著性差異代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)果與分析

3.1 代謝組學(xué)分析

通過文獻報道數(shù)據(jù)[11-13]以及BMRB數(shù)據(jù)庫(www.bmrb.wisc.edu.com)對照，從山藥與麩炒山藥圖譜中指認(rèn)出23個代謝產(chǎn)物。

由圖1可見，山藥與麩炒山藥的核磁圖譜大致可以分為3個區(qū)域，即脂肪區(qū)、碳水化合物區(qū)和芳香區(qū)。脂肪區(qū)位于高場端，化合物主要為有機酸和氨基酸。在脂肪區(qū)(δH3.10～δH0.00)，山藥與麩炒山藥信號相似，共有的氨基酸包括丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、γ-氨基丁酸等，共有的有機酸包括檸檬酸、蘋果酸等。碳水化合物區(qū)(δH5.50～δH3.10)主要為糖類物質(zhì)，包括α-葡萄糖、β-葡萄糖、蔗糖以及尿囊素等。由于麩炒山藥在炒制過程中會有糖類的損失，故山藥中的α-葡萄糖較麩炒山藥而言含量高。另外由于糖類成分復(fù)雜，且結(jié)構(gòu)相近，糖區(qū)信號重疊非常嚴(yán)重，難以鑒定指認(rèn)出更多的糖類物質(zhì)。芳香區(qū)位于譜圖的低場區(qū)(δH10.0～δH5.50)，化合物類型主要是芳香氨基酸。指認(rèn)的芳香氨基酸包括苯丙氨酸和酪氨酸。此外在圖譜中還檢測到了5-羥甲基糠醛、葫蘆巴堿、尿苷、腺苷和甲酸等化合物。指認(rèn)的各類化合物的核磁數(shù)據(jù)見表1。

由于山藥、麩炒山藥的化學(xué)組成復(fù)雜，得到的核磁圖譜中含有大量的化學(xué)指紋信息，因此，需借助多元統(tǒng)計分析方法對兩者進行深入比較。

注：A.麩炒山藥；B.山藥。圖1 山藥與麩炒山藥的1H-NMR圖譜

3.2 多元統(tǒng)計分析

3.2.1 HCA分析 HCA是以分類依據(jù)的條件作為指標(biāo)或變量，把要對其進行分類的對象作為樣品，根據(jù)它們所表現(xiàn)的變量特征，按相似程度的大小或親疏關(guān)系加以歸類，樣品間距離越短，相似性越高，則越容易聚為一類，最后把分類系統(tǒng)直觀地用圖形(如樹狀圖)表示出來[14]。本文中HCA是以各樣品的氫核磁共振峰的積分值為指標(biāo)或變量進行分析。

山藥與麩炒山藥的聚類結(jié)果如樹狀圖所示(見圖2)，其中橫坐標(biāo)表示樣品間距離的大小，縱坐標(biāo)為樣品編號。在樹狀圖中，每個樣本平行做兩份的明顯聚在一起，說明測試過程的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。山藥樣本9～16號明顯聚在一類，說明不同批次的山藥樣本之間差異較小，可以歸為一類。而不同批次的麩炒山藥樣本沒有聚在一起，且隨著橫坐標(biāo)的增大，1～4號樣本先與山藥樣本聚為一類，說明1～4號樣本與山藥的化學(xué)成分差異較小，7～8號樣本和5～6號樣本與山藥的差異較大。這也說明了不同批次的麩炒山藥由于廠家、炮制的工藝不同而導(dǎo)致了不同麩炒山藥之間的差異較大，未能聚成一類。

表1 山藥、麩炒山藥中主要化合物的NMR數(shù)據(jù)歸屬

圖2 山藥與麩炒山藥的HCA 分析結(jié)果

3.2.2 PCA分析 PCA分析是以一種有序的方式提取并保留了有用的信息，連續(xù)的主成分所包含的信息量越來越少。PCA分析的得分圖能方便地對不同類別進行判別，在得分圖中，在該主成分上投影值的絕對值越大，表明該主成分對該類的區(qū)分有著越大的影響[15]。本研究中PCA分析所用軟件為SIMCA-P13.0。

對山藥、麩炒山藥提取物進行PCA分析，以主成分1的得分值(t1)和主成分2的得分值(t2)為橫縱坐標(biāo)構(gòu)建得分散點圖(見圖3A)。由圖3可以看出，第1主成分和第2主成分可以解釋63.8%(t1：53.2%，t2：10.6%)的原變量信息，不同批次的山藥樣本明顯聚集在一起，說明組內(nèi)差異小，即組內(nèi)聚集；而不同批次的麩炒山藥比較分散，說明組內(nèi)差異較大，原因在于不同廠家炮制工藝不同而導(dǎo)致差異較大。該結(jié)果與HCA分析相吻合。

由于PCA分析是無監(jiān)督的分析方法，只反映了數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，即觀察到的試驗樣品的自然分布和組別關(guān)系，不能忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無關(guān)的隨機誤差，為了進一步分析組別差異，確定山藥與炒山藥的化學(xué)差異成分，本研究繼續(xù)采用有監(jiān)督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析對數(shù)據(jù)進行分析。

3.2.3 PLS-DA分析及OPLS-DA分析 PLS-DA分析和OPLS-DA分析是有監(jiān)督的模式識別方法。PLS-DA分析著重強調(diào)組間的差異，而將組內(nèi)的差異降至最低，更能把握多維數(shù)據(jù)的整體特征和變異規(guī)律。OPLS-DA分析可以去除與Y矩陣(在本研究中Y為分組信息)無關(guān)的X矩陣的變化，從而使X矩陣和Y變量之間的關(guān)系最大化，即可以使兩組分類的差別達到最大，從而確定兩組之間的化學(xué)差異成分。

本研究先對山藥與炒山藥進行PLS-DA分析，其模型參數(shù)為R2=91.0%，Q2=98.8%，證明模型可靠。另一方面，可用排列實驗證明模型的有效性(見圖3B)。表示Q2的回歸線與左邊縱軸相交并處于零點以下，左端任何一次隨機排列產(chǎn)生的R2、Q2均小于右端，且兩條回歸線斜率較大，最右端的兩個值差距較小，說明原始模型的預(yù)測能力大于任何一次隨機排列Y變量的預(yù)測能力，可見上述方法模型是有效的。圖3C為OPLS-DA的得分散點圖，從圖中明顯得出，與無監(jiān)督的PCA得分圖相比，山藥與麩炒山藥樣本有最大程度的分離，這樣便于更準(zhǔn)確地尋找化學(xué)差異代謝物。結(jié)合S-Plot圖(圖3D)和VIP值，在VIP值大于0.7的范圍內(nèi)尋找差異標(biāo)志物。結(jié)果顯示山藥中丙氨酸、谷氨酰胺及蘋果酸的含量較高，而麩炒山藥中異亮氨酸、亮氨酸、蔗糖、α-葡萄糖、γ-氨基丁酸、天冬酰胺、酪氨酸及苯丙氨酸的含量較高。

注：A.PCA得分散點圖；B.排列實驗；C.OPLS-DA得分散點圖；D.S-Plot圖。圖3 山藥與麩炒山藥的多元統(tǒng)計分析

在SPSS 16.0中進一步采用t檢驗來驗證上述結(jié)果，如表2所示，山藥與麩炒山藥中異亮氨酸、蔗糖、α-葡萄糖、γ-氨基丁酸、天冬酰胺的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，酪氨酸差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.2.4 遞歸支持向量機分析(R-SVM)

采用Metaboanalyst網(wǎng)站的R-SVM分析對山藥和麩炒山藥的差異成分進行分析。R-SVM分析根據(jù)各個特征在svm分類器中的貢獻率大小從分類結(jié)果中提取使分類器性能最好的特征，以實現(xiàn)維數(shù)約簡的目的[16]。從圖4A中可以看出，當(dāng)變量的數(shù)目是98，錯誤率是0%，當(dāng)變量數(shù)目為29～49時，錯誤率提高到3.1%，這表明NMR圖譜能正確區(qū)分山藥與麩炒山藥。從圖4B中可以看出，由天冬酰胺、蔗糖、α-葡萄糖、酪氨酸以及未知特征峰6.73、6.41、6.33、6.29、4.57、4.37、3.41、3.37、3.45、5.45、5.17是區(qū)分山藥與麩炒山藥的主要差異代謝物，且在麩炒山藥中的含量較高，與多元統(tǒng)計分析及t檢驗分析的結(jié)果一致。

表2 山藥與麩炒山藥差異代謝物

注：(1)*P<0.05，**P<0.01；(2)↑表示在山藥中含量高，↓表示在麩炒山藥中含量高。

注：A.遞歸SVM分類圖；B.差異變量圖。圖4 山藥、麩炒山藥R-SVM分析

4 討論

本研究采用基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)對山藥與麩炒山藥的化學(xué)差異進行了比較，結(jié)合多元統(tǒng)計分析、t檢驗以及R-SVM分析結(jié)果，可以看出山藥與麩炒山藥存在顯著的化學(xué)差異，山藥中丙氨酸、谷氨酰胺及蘋果酸的含量較高，麩炒山藥中異亮氨酸、亮氨酸、蔗糖、α-葡萄糖、γ-氨基丁酸、天冬酰胺、酪氨酸及苯丙氨酸的含量較高。在中醫(yī)臨床中，山藥的功效以補腎澀精、益肺斂陰為主，而麩炒山藥以補脾健胃為主。本研究確定的山藥與麩炒山藥的差異成分與功效差異的相關(guān)性值得進一步深入研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同麩炒山藥之間的化學(xué)組成差異較大，而山藥之間的差異較小，說明炮制工藝對麩炒山藥的影響較大。麩炒山藥是中醫(yī)臨床常用中藥，為了保證臨床用藥的安全有效，應(yīng)進一步規(guī)范麩炒山藥的炮制工藝，保證中藥飲片質(zhì)量的均一穩(wěn)定。

在植物代謝組學(xué)分析中，核磁共振的優(yōu)勢體現(xiàn)在所檢測化學(xué)成分的類型較全面，可以檢測含有氫原子的大多數(shù)化合物，尤其適合于在液相色譜柱上不保留的強極性成分和無紫外吸收的化學(xué)成分。此外，代謝組學(xué)技術(shù)的核心是數(shù)據(jù)的預(yù)處理方法和統(tǒng)計方法的正確選擇和應(yīng)用。多種分析手段將產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，如何在數(shù)據(jù)分析中剔除冗余信息，以及如何有效整合多種分析技術(shù)產(chǎn)生的多維數(shù)據(jù)，及其預(yù)處理和統(tǒng)計分析均具有極大的難度[17]。因此將核磁共振技術(shù)與多種多元統(tǒng)計分析方法相結(jié)合，可以準(zhǔn)確確定差異成分，發(fā)現(xiàn)樣本之間的細微差異。綜上所述，采用核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)對中藥材進行質(zhì)量分析，不僅備樣簡單、分析時間短，而且可以多成分反映藥材的化學(xué)組成信息，有望為中藥材的質(zhì)量控制提供新的思路。

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ComparisonofChemicalComponentsbetweenDioscoreaeRhizomaandDioscoreaeRhizomaPreparatausingNMRSpectroscopy

DONGTaishan1，HANXiaojing2*

(1.NCMSManagementCenterofGaoping，Jincheng048400，China；2.ShanxiPharmaceuticalCollege，Taiyuan030031，China)

Objective：To compare the chemical components of Rhizoma Dioscoreae(RD)and Rhizoma Dioscoreae Preparata(RDP)，and provide a basis for quality evaluation.Methods：NMR-based metabolomic approach combined with cluster analysis，Principal component analysis(PCA)and some other multivariate statistical analysis were used to investigate the differential metabolites of RD and RDP.Results：Twenty-three metabolites were identified in the1H-NMR spectra，and the multivariate statistical analysis showed that RD and RDP could be separated clearly.RD contained more alanine，glutamaine，and marlic acid，while RDP more isoleucine，leucine，sucrose，α-glucose，GABA，asparagine，tyrosine and phenylalanine.Conclusion：The results revealed the chemical differences between RD and RDP in a holistic way，and provide a scientific basis for assessing the quality of RD and RDP.

Rhizoma Dioscoreae；Rhizoma Dioscoreae Preparata；NMR；multivariate statistical analysis

2014-11-06)

*

韓曉靜，講師，研究方向：中藥活性成分、藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Tel：(0351)2392535，E-mail：jitazhilian@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.7.007