李 云，黃榮城，許俊凰

(韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521041)

紅菇子實(shí)體多糖抑菌活性研究

李 云，黃榮城，許俊凰

(韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521041)

以紅菇子實(shí)體為原料，采用超聲波方法提取水溶性多糖，從中分離純化了3個(gè)組分(R1、R2、R3)，研究其對(duì)多種敏感菌的抑菌活性。結(jié)果表明：組分R1具有明顯的抑菌活性，能夠抑制細(xì)菌，其中對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌活性強(qiáng)于革蘭氏陽性菌，對(duì)酵母和霉菌無抑制效果；而R2無抑菌活性，R3抑菌活性弱。組分R1對(duì)各供試菌株的最小抑制質(zhì)量濃度分別為金黃色葡萄球菌2.5 mg·mL-1，藤黃微球菌10 mg·mL-1，蠟樣芽孢桿菌5 mg·mL-1，枯草芽孢桿菌10 mg·mL-1，大腸桿菌1.0 mg·mL-1，銅綠假單胞菌1.25 mg·mL-1，痢疾志賀氏菌1.25 mg·mL-1；具有較好的耐熱性和較寬的pH適用范圍，在80 ℃處理30 min和pH 6～10都能維持很好的抑菌活性；其抑菌作用方式是殺菌，對(duì)菌體無溶菌作用。

紅菇；子實(shí)體多糖；抑菌作用

紅菇(Russulasp.)是一種著名的野生食藥用菌，常與殼斗目等種子植物形成外生菌根，菌根的形成擴(kuò)大了宿主植物根系的吸收表面積，增強(qiáng)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，促進(jìn)植物體內(nèi)的水分運(yùn)輸，提高抗旱性和抗逆性，是林木生長(zhǎng)的重要因子[1]。紅菇主要分布在廣東、福建、云南和貴州等地區(qū)，目前尚無法人工栽培，野生資源缺乏保護(hù)性開發(fā)而日漸稀缺。紅菇是粵東梅州地區(qū)著名土特產(chǎn)，主要分布于蕉嶺至大埔一帶山地林間，其子實(shí)體在民間有悠久的食用歷史，不僅味道鮮美，而且因其被認(rèn)為具有藥用保健的功效，倍受消費(fèi)者推崇。陳新華[2]通過對(duì)紅菇子實(shí)體rDNA 的ITS和28S rDNA序列比較分析，鑒定粵東商品紅菇屬于灰肉紅菇(Russulagriseocarnosa)，目前尚未見到分離出經(jīng)分子鑒定純培養(yǎng)菌種的報(bào)道。

多糖是食藥用菌類重要的生理活性物質(zhì)，食藥用菌多糖除具有抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，抗炎等生理作用外，還具有抑菌的效果[3]。體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅菇子實(shí)體多糖具有抗氧化、抑制癌細(xì)胞、降血糖和血脂等生物活性作用[4-5]，而對(duì)紅菇多糖抑菌活性的研究較少。本研究以灰肉紅菇為原料，采用超聲波方法提取水溶性多糖，研究了其對(duì)多種敏感菌的抑菌活性及相關(guān)性質(zhì)，為進(jìn)一步研究了解紅菇的價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生紅菇子實(shí)體采集于廣東省梅州市焦嶺縣山地林間，子實(shí)體于45 ℃烘箱干燥后，粉碎過40目篩，篩粉干燥保藏備用。

敏感菌供試菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)(ATCC 8099)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC 15442)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC 6538)、白假絲酵母(Candidaalbicans)(ATCC 10231)、黑曲霉(Aspergillusniger)(ATCC 16404)來自廣東省微生物所?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)(CMCC63501)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)(CMCC 63301)、大腸桿菌(Escherichiacoli)(ATCC 35218)來自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、灰綠青霉(Penicilliumglaucum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保藏。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)菌，YPD培養(yǎng)基用于培養(yǎng)酵母，PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)霉菌。

1.2 方法

1.2.1 紅菇子實(shí)體多糖的提取和初步純化 取紅菇子實(shí)體干粉按文獻(xiàn)[6]中方法采用超聲波技術(shù)提取水溶性多糖。提取上清液采用Sevage法除蛋白，去除蛋白后水相加入4倍體積的95%乙醇，4 ℃沉淀過夜。8000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄上清液，沉淀置于空氣中揮發(fā)乙醇。沉淀溶解于pH 8、0.2 mol·L-1的磷酸緩沖溶液，60 ℃提取1 h，再次離心取上清液，冷凍干燥制成粗多糖干粉。

粗多糖溶于5 mL蒸餾水中，經(jīng)0.45 μm微濾膜過濾后，上樣于DEAF-52纖維素陰離子層析柱(2.6 cm×40 cm)，采用蒸餾水至0.5 mol·L-1的NaCl溶液梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，每10 mL采用自動(dòng)收集器收集。采用硫酸-苯酚法[7]于490 nm測(cè)定收集液中的多糖含量。依據(jù)洗脫峰型合并相同組分，蒸餾水中透析48 h脫鹽，將透析內(nèi)液冷凍干燥，得到純化后多糖。紅菇多糖經(jīng)DEAF-52纖維素陰離子層析柱分離后，收集液分析多糖得到3個(gè)組分，分別命名為R1、R2和R3。分離組分分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)紫外掃描，未見有核酸和蛋白吸收峰，說明各分離組分不含有蛋白和核酸等雜質(zhì)。

1.2.2 紅菇子實(shí)體多糖的抑菌活性的測(cè)定

1)采用牛津杯法測(cè)定抑菌活性：細(xì)菌與酵母指示菌接種于培養(yǎng)基適溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600nm=0.6)，霉菌收集孢子后溶于無菌水中調(diào)整至106～107孢子·mL-1，取指示菌液0.5 mL涂布于平板表面，均勻放置牛津杯，將待測(cè)各組分配制成20 mg·mL-1的多糖溶液，每杯中點(diǎn)樣100 μL，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，酵母和霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)量抑菌圈直徑，每樣重復(fù)3次。

2)最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：將多糖溶液進(jìn)行稀釋，配制成10、5、2.5、1.25、1.0、0.8、0.4 mg·mL-1溶液，進(jìn)行牛津杯法測(cè)定抑菌活性。

3)溫度和pH對(duì)紅菇多糖抑菌的影響：20 mg·mL-1多糖溶液分別置于50、60、80、100、121 ℃保持10 min和30 min，冷卻后以大腸桿菌作為指示菌測(cè)定抑菌活性。分別用1 mol·L-1的HCl或NaOH調(diào)多糖溶液pH值至3～10，30 ℃下保溫2 h，以相同pH的無菌HCl或NaOH溶液作為對(duì)照，同上述溫度處理，測(cè)定處理液抑菌活性。

4)紅菇多糖抑菌作用方式：按1%接種量將大腸桿菌(ATCC35218)接種于100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(10 h)，加入無菌過濾后的50 mg·mL-1的多糖溶液10 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定OD600nm和活菌數(shù)，以加入10 mL無菌水作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅菇多糖的抑菌作用

紅菇多糖分離純化組分R1、R2和R3抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。在多糖20 mg·mL-1條件下，組分R1展現(xiàn)出很好的抑菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陽性菌，對(duì)供試的金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌有抑制作用，對(duì)2株大腸桿菌、銅綠假單胞菌和痢疾志賀氏菌有較強(qiáng)的抑制作用；組分R2無抑菌活性；而R3抑菌活性弱，僅對(duì)藤黃微球菌和大腸桿菌表現(xiàn)出弱的抑制作用。3種多糖組分均未發(fā)現(xiàn)對(duì)酵母菌和霉菌有抑制作用。

2.2 紅菇多糖最小抑菌濃度

將組分R1稀釋后，測(cè)定其對(duì)不同敏感菌的最小抑制濃度(Minimum inhibition concentration MIC)，結(jié)果見表2。由表2可知，其最小抑制質(zhì)量濃度分別為金黃色葡萄球菌2.5 mg·mL-1，藤黃微球菌10 mg·mL-1，蠟樣芽孢桿菌5 mg·mL-1，枯草芽孢桿菌10 mg·mL-1，大腸桿菌1.0 mg·mL-1，銅綠假單胞菌1.25 mg·mL-1，痢疾志賀氏菌1.25 mg·mL-1。R1對(duì)革蘭氏陰性菌的最小抑菌濃度明顯低于革蘭氏陽性菌。

2.3 溫度和pH對(duì)紅菇多糖抑菌活性的影響

溫度對(duì)紅菇多糖抑菌活性的影響見圖1。由圖1可知，在50 ℃處理10、30 min抑菌活性變化不大，抑菌圈直徑與對(duì)照相比變化不大；60 ℃處理10、30 min抑菌活性有所下降，抑菌圈直徑分別為15.7、15.3 mm；80 ℃處理10、30 min 后活性下降顯著，但仍然保持了較高的抑菌活性；100 ℃處理10 min僅能測(cè)到微弱活性，處理30 min活性消失；121 ℃處理后無活性。表明溫度對(duì)紅菇多糖抑菌活性有顯著影響，紅菇多糖在80 ℃以下能保持較好的抑菌活性。

表1 紅菇子實(shí)體多糖的抑菌作用

表2 紅菇子實(shí)體多糖的最小抑菌濃度

*：-為無抑菌圈，+為抑菌圈在6～8 mm，++為抑菌圈在8～10 mm，+++為抑菌圈在10 mm以上。

pH對(duì)紅菇多糖抑菌活性的影響見圖2，在pH 6～10范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的抑菌活性，抑菌圈直徑均在12 mm以上，pH<5和pH>11時(shí)，抑菌活性下降顯著，雖然能夠測(cè)到一定的抑菌活性，但是相同pH的對(duì)照也表現(xiàn)出一定的抑菌活性，說明此時(shí)的pH對(duì)敏感菌產(chǎn)生抑菌作用。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，紅菇多糖在pH 6～10范圍內(nèi)抑菌活性最好。

2.4 紅菇多糖的抑菌作用方式

在培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌ATCC35218培養(yǎng)液中加入R1組分溶液，考查紅菇多糖的抑菌作用方式，結(jié)果見圖3。培養(yǎng)10 h時(shí)加入紅菇多糖后，大腸桿菌的活菌數(shù)和OD600nm并沒有立即降低，在培養(yǎng)10～12 h內(nèi)出現(xiàn)小幅增加，12 h后活菌數(shù)顯著下降，說明菌體生長(zhǎng)從開始受到抑制到后期被殺死；但加入多糖后，菌液OD值變化不大，說明敏感菌細(xì)胞并未出現(xiàn)破裂溶菌現(xiàn)象。表明紅菇多糖的抑菌作用方式是殺菌，對(duì)菌體無溶菌作用。

圖1 溫度對(duì)紅菇多糖抑菌活性的影響圖2 pH對(duì)紅菇多糖抑菌活性的影響

圖3 紅菇多糖抑菌活性的作用方式

3 結(jié)論與討論

本文對(duì)超聲波提取的紅菇水溶性多糖進(jìn)行分離純化得到3個(gè)組分，3個(gè)多糖組分表現(xiàn)出不同的抑菌活性，組分R1抑菌活性最好，主要能夠抑制細(xì)菌，其中對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌活性強(qiáng)于革蘭氏陽性菌，對(duì)酵母和霉菌無抑制效果；各供試菌株的最小抑制質(zhì)量濃度分別為金黃色葡萄球菌2.5 mg·mL-1，藤黃微球菌10 mg·mL-1，蠟樣芽孢桿菌5 mg·mL-1，枯草芽孢桿菌10 mg·mL-1，大腸桿菌1.0 mg·mL-1，銅綠假單胞菌1.25 mg·mL-1，痢疾志賀氏菌1.25 mg·mL-1。在對(duì)敏感細(xì)菌的抑制作用方面，紅菇多糖表現(xiàn)出較好的耐熱性和較寬的pH適用范圍，在80 ℃以下和pH 6～10都能維持很好的抑菌活性。

多糖對(duì)細(xì)菌抑制作用的確切機(jī)制尚未完全清楚，從目前研究較多的殼聚糖的抑菌機(jī)制看，一般認(rèn)為可分為3種方式[8-9]，大分子量的多糖不能穿過細(xì)胞膜，只能與細(xì)胞表面相互作用，如和細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，以改變細(xì)胞通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，破壞了細(xì)菌細(xì)胞的完整性使菌體死亡?；蛘呤嵌嗵窃诩?xì)胞周圍形成傳質(zhì)阻礙的膜，從而阻礙和改變了細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，導(dǎo)致細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏死亡。小分子水溶性多糖通過受損傷的細(xì)胞表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，干擾菌體的大分子的合成和代謝，從而抑制細(xì)菌。本文對(duì)紅菇多糖抑菌的作用方式研究紅菇多糖對(duì)敏感菌是殺菌作用，而且對(duì)其菌體無溶菌作用，對(duì)于紅菇多糖的具體抑菌機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。

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Antibacterial Activity of Polysaccharide Extracted from Fruit Body ofRussulasp.

LI Yun，HUANG Rong-cheng，XU Jun-huang

(DepartmentofBiology，HanshanNormalUniversity，Chaozhou521041，Guangdong，China)

The water-soluble polysaccharide was extracted using ultrasound method from fruit body ofRussulasp.，which was collocted from wild resources in eastern Guangdong province.Three components were sperated and purified from crude polysaccharide using chromatography.The component R1exhibited strong antibacterial activity towards Gram-negative bacteria than Gram-positive bacteria，and had no activity to yeast and mold.Fraction R2didn′t show any antibacterial actility and fraction R3showed weak actility.The minimum inhibitory concentration for each of the tested strains were Staphylococcus aureus 2.5 mg·mL-1，Micrococcus luteus 10 mg·mL-1，Bacillus cereus 5 mg·mL-1，Bacillus subtilis 10 mg·mL-1，Escherichia coli 1.0 mg·mL-1，Pseudomonas aeruginosa 1.25 mg·mL-1，Shigella dysentery 1.25 mg·mL-1.The polysaccharide has good heat resistance and a wide pH range，it can maintain a good antibacterial activity at 80 ℃ for 30 min and pH 6～10.The Antimicrobial mode of action of action of the polysaccharides is sterilization，no cell lysis.

Russulasp.；polysaccharide of fruit body；antibacterial activity

2014-06-18；

2014-08-17

廣東省潮州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010N09)；韓山師范學(xué)院青年基金資助(LQ200808)

李云(1977—)，男，湖北宜昌人，韓山師范學(xué)院生物系講師，碩士，從事食品微生物和功能食品開發(fā)研究。E-mail：fgtmyself@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.02.022

S759.81；Q949.32

A

1002-7351(2015)02-0098-05