邱小惠， 林 嘉， 余傳林， 陳娜娜， 雷林生

(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510515)

四氫嘧啶類化合物具有多種生物活性，其中之一為抗炎鎮(zhèn)痛。文獻(xiàn)報(bào)道，6-氨基-4-酮-1，3-二苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-羰基衍生物可抑制白細(xì)胞介素8誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的趨化作用［1］。3-(1-取代苯乙酮基)-4-(取代苯基)-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-羧酸衍生物對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎效果明顯［2］。某些4，5，6-三苯基-1，2，3，4-四氫嘧啶衍生物具有環(huán)氧化酶 2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制活性［3-4］。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道，1，3-取代基-1，2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯類化合物具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用［5-6］，其中，1，3-二環(huán)戊基-1，2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯(ZL-5015)具有抗炎及免疫抑制雙重作用，體外實(shí)驗(yàn)證明其可抑制細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子的分泌，同時(shí)可促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10的分泌［6］，提示其具有抗內(nèi)毒素作用。據(jù)此，本文探討了ZL-5015對內(nèi)毒素所致小鼠中毒死亡的作用及初步機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級C57BL/6J小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量18～20 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2011-0015。

1.2 主要試劑 ZL-5015參照文獻(xiàn)方法［7］合成，采用硅膠柱分離純化，其結(jié)構(gòu)經(jīng)13C-NMR、1H-NMR和MS確證;灌胃給藥時(shí)，采用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制;體外實(shí)驗(yàn)時(shí)先采用二甲基亞砜(DMSO)配制成儲存液，然后用完全培養(yǎng)基稀釋成工作液，使DMSO的終濃度為0.1%。小鼠IL-1β、IL-10和TNF-α檢測試劑盒(eBioscience);TRIzol(Invitrogen);mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及real-time PCR試劑盒(Bioteke);DMEM高糖培養(yǎng)液(Thermo);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);銅綠假單胞菌LPS(Sigma);地塞米松(dexamethasone，Dex)磷酸鈉注射液(廣州白云山天心制藥股份有限公司);其它試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(Tecan);PCR儀(Bio-Rad);實(shí)時(shí)定量PCR儀(Stratagene);CO2培養(yǎng)箱(Thermo);臺式冷凍型高速離心機(jī)(Eppendorf);電子分析天平(Denver Instrument)。

2 主要方法

2.1 內(nèi)毒素致死模型實(shí)驗(yàn) 取小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組16只，即:LPS組:灌胃0.5%CMC-Na的水溶液10 mL/kg體重;ZL-5015(高、中和低劑量)+LPS組:分別以200和100、50 mg/kg的ZL-5015灌胃;Dex+LPS組:皮下注射地塞米松10 mg/kg。給藥后30 min，每組動物均腹腔注射內(nèi)毒素70 mg/kg，之后，每6 h 1次，觀察3 d內(nèi)動物死亡情況。LPS和ZL-5015的劑量選擇由預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。

2.2 內(nèi)毒素血癥模型實(shí)驗(yàn)

2.2.1 待測化合物對血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子影響的時(shí)效動態(tài)研究 取小鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，每組50只，即LPS組:灌胃0.5%CMC-Na的水溶液10 mL/kg體重;ZL-5015(高劑量)+LPS組:以200 mg/kg的 ZL-5015灌胃。給藥后0.5 h，2組小鼠均腹腔注射內(nèi)毒素70 mg/kg，分別于注射后1、3、6、9、12 h，每組取 10 只小鼠，經(jīng)眼球取血，將血液收集于1.5 mL的EP管中，室溫傾斜放置1 h，待血清充分析出后，2 000 r/min離心5 min，收集血清用于IL-1β、IL-10和TNF-α的測定。

2.2.2 待測化合物作用的劑量依賴關(guān)系研究 動物分組及給藥同2.1所述，每組10只小鼠。注射LPS后3 h，經(jīng)眼球取血，按2.2.1節(jié)所述分離血清用于IL-1β、IL-10和TNF-α的測定。

2.3 內(nèi)毒素體外致炎實(shí)驗(yàn)

2.3.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 采用文獻(xiàn)［6］方法獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基接種于6孔板中，每孔3×106個細(xì)胞，在飽和濕度、5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h讓其充分貼壁，然后用Hanks液洗棄未貼壁細(xì)胞后用于以下實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 共分為6組，即空白(blank)對照組:僅含完全培養(yǎng)基;LPS組:含完全培養(yǎng)基和LPS(10 mg/L);ZL-5015(高、中、低濃度)+LPS 組:含完全培養(yǎng)基、ZL-5015(40、20、10 μmol/L)和LPS;Dex+LPS組:含完全培養(yǎng)基、地塞米松(1 μmol/L)和LPS。各組DMSO的終濃度均為0.1%，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集上清液分別用于IL-1β、IL-10和TNF-α含量的測定;然后提取細(xì)胞中的總RNA用于上述細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的測定。

2.4 IL-1β、IL-10和 TNF-α 含量的檢測 采用ELISA方法，測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，最后用酶標(biāo)儀測量450 nm波長處的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的含量。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA的表達(dá)水平 PCR引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。IL-1β的上游引物為 5’-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游引物為 5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’;IL-10的上游引物為 5’-GACCAGCTGGACAACATACTGCTAA-3’，下游引物為 5’-GATAAGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3’;TNF-α 的上游引物為 5’-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3’，下游引物為 5’-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3’;GAPDH 的上游引物為5’-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3’，下游引 物 為 5’-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3’。采用TRIzol試劑提取總RNA，然后取1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，接著以 cDNA為模板擴(kuò)增IL-1β、IL-10、TNF-α及內(nèi)參照GAPDH，逆轉(zhuǎn)錄及基因片段擴(kuò)增依試劑盒提供的方法進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄條件為:30℃10 min;42℃ 60 min;95℃ 5 min。擴(kuò)增條件為95℃2 min;95℃ 20 s;60℃ 20 s，72℃ 60 s，共40循環(huán);結(jié)果采用2－ΔΔCt進(jìn)行相對定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小鼠死亡率采用Kaplan-Meier法分析，時(shí)效動態(tài)實(shí)驗(yàn)?zāi)骋粫r(shí)點(diǎn)的均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊時(shí)采用LSD法、不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ZL-5015提高致死劑量內(nèi)毒素攻擊小鼠的存活率和存活時(shí)間

腹腔注射致死劑量(70 mg/kg)LPS后，小鼠先是出現(xiàn)煩躁多動，毛色失去光澤，繼之行動遲緩，逐漸蜷縮在一起，對外來刺激無反應(yīng)，拒食。24 h后動物開始死亡，存活動物會陰部污穢潮濕，生命垂危。48 h后仍存活的動物逐漸恢復(fù)正?；顒优c攝食。各組動物生存情況見圖1，統(tǒng)計(jì)分析表明，模型組動物存活率為12.50%;高、中和低劑量(200、100和50 mg/kg)實(shí)驗(yàn)組動物存活率分別為37.50%、31.25%和18.75%;Dex+LPS組存活率為87.50%。與模型組比較，高、中劑量ZL-5015組和Dex組動物存活率均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Figure 1.The effect of ZL-5015 on survival rate and survival time of the mice subjected to lethal LPS challenge.Mean±SD.n=15.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs LPS group.圖1 ZL-5015對內(nèi)毒素中毒小鼠存活率和存活時(shí)間的影響

2 ZL-5015體內(nèi)給藥抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，提高抑炎細(xì)胞因子IL-10的水平

LPS組小鼠經(jīng)腹腔注射LPS 1 h后，血清中TNF-α和IL-10的水平達(dá)峰值，之后逐漸下降，6 h后維持在低水平。給予LPS 3 h后，血清IL-1β才有明顯升高，之后呈現(xiàn)平臺狀，12 h后再度升高。經(jīng)ZL-5015預(yù)處理的動物再注射LPS，其血清中IL-1β和TNF-α的水平明顯低于LPS組，相反，處理組動物血清中IL-10的水平高于LPS組，在1 h和3 h時(shí)差異顯著(P＜0.05)，見圖2。如表1所示，給予LPS 3 h后，ZL-5015預(yù)處理劑量為100和200 mg/kg時(shí)，與LPS組相比，IL-1β的下降顯著(P＜0.01);劑量為50、100和200 mg/kg時(shí)，TNF-α的下降與LPS組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相反，ZL-5015處理組血清中IL-10的水平略高于模型組，劑量為100和200 mg/kg時(shí)，差異顯著(P＜0.05)。

Figure 2.Time course of the effect of ZL-5015(200 mg/kg)on serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-10 in LPS-induced mice.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs LPS group.圖2 ZL-5015對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平影響的時(shí)效動態(tài)關(guān)系

表1 ZL-5015對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響Table 1.The effect of ZL-5015 on serum levels of inflammation-associated cytokines in LPS-induced mice(Mean±SD.n=10)

3 ZL-5015體外抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α，促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生

如表2所示，在體外培養(yǎng)的條件下，正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能分泌少量的IL-1β和TNF-α，IL-10的分泌量尚未達(dá)到試劑盒檢測的最低值，經(jīng)LPS刺激以后，3種細(xì)胞因子的含量大幅增加，在 ZL-5015(10、20 和 40 μmol/L)存在的情況下，LPS 誘導(dǎo) IL-1β和TNF-α的分泌作用明顯下降，與LPS組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相反，對IL-10的分泌具有輕度的促進(jìn)作用，濃度為20和40 μmol/L時(shí)與LPS模型組相比差異顯著(P＜0.01)。

表2 ZL-5015對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的影響Table 2.Effect of ZL-5015 on production of inflammation-associated cytokines in LPS-induced mouse peritoneal macrophages in vitro(Mean±SD.n=6)

4 ZL-5015體外抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)，促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA的表達(dá)

如表3所示，在體外培養(yǎng)的條件下，正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)少量的IL-1β、TNF-α和IL-10 mRNA，經(jīng)LPS刺激以后，3種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量明顯增加，在 ZL-5015(10、20 和 40 μmol/L)存在的情況下，LPS誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的mRNA的表達(dá)量明顯下降(P＜0.01);相反，對IL-10的表達(dá)具有輕度的促進(jìn)作用，濃度為20和40 μmol/L時(shí)與LPS組相比差異顯著(P＜0.05)。

表3 ZL-5015對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的影響Table 3.The effect of ZL-5015 on mRNA expression of inflammation-associated cytokines in LPS-induced mouse peritoneal macrophages in vitro(Mean±SD.n=6)

討 論

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的結(jié)構(gòu)成分，其化學(xué)本質(zhì)為LPS。在創(chuàng)傷、感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征及膿毒癥中，內(nèi)毒素是重要的致病因子，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致休克、彌漫性血管內(nèi)凝血和多器官功能衰竭、甚至死亡。一般認(rèn)為，抗內(nèi)毒素治療是提高膿毒癥治療效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［8］，因此，尋找有效的抗內(nèi)毒素藥物具有重要的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，四氫嘧啶類化合物ZL-5015具有抗內(nèi)毒素作用，表現(xiàn)為提高被致死量內(nèi)毒素攻擊小鼠的存活率和延長存活時(shí)間，體內(nèi)外均能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，提高抑炎細(xì)胞因子IL-10的水平，提示該類化合物在治療內(nèi)毒素血癥方面的應(yīng)用前景。

TNF-α和IL-1β是重要的促炎細(xì)胞因子，參與多種炎癥反應(yīng)，在內(nèi)毒素血癥時(shí)，血中TNF-α和IL-1β的水平大幅升高，因此，在研究化合物的抗炎、抗內(nèi)毒素作用時(shí)，TNF-α和IL-1β是經(jīng)常被選用的評價(jià)指標(biāo)［9-10］。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道ZL-5015體外能抑制TNF-α的分泌［6］，本研究從體內(nèi)、體外兩個層次觀察了ZL-5015對TNF-α產(chǎn)生的影響，并增加IL-1β作為另一促炎細(xì)胞因子的評價(jià)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZL-5015在劑量為100和200 mg/kg時(shí)能降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠血清 TNF-α和 IL-1β的水平，體外在濃度為10 μmol/L以上時(shí)能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β，并能抑制其mRNA的表達(dá)，提示ZL-5015的抗內(nèi)毒素作用與抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)與產(chǎn)生有關(guān)。

IL-10是公認(rèn)的抑炎細(xì)胞因子，具有抗炎和免疫抑制作用［11］，本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道ZL-5015體外能促進(jìn)IL-10的分泌［6］，在此基礎(chǔ)上，本研究從體內(nèi)、體外兩個層次觀察了ZL-5015對IL-10產(chǎn)生及其mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZL-5015在劑量為100和200 mg/kg時(shí)對內(nèi)毒素攻擊小鼠血清中IL-10的水平有一定的提升作用，體外在濃度為20 μmol/L以上時(shí)能促進(jìn)內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-10，并能促進(jìn)其mRNA的表達(dá)，提示促進(jìn)IL-10的表達(dá)和產(chǎn)生與ZL-5015的抗內(nèi)毒素作用有關(guān)。這一點(diǎn)與甾體類抗炎藥地塞米松不同，后者體外對LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-10有輕微的抑制作用，說明ZL-5015的作用機(jī)制不同于甾體類抗炎藥。在體內(nèi)情況下，由于地塞米松還能促進(jìn)其它免疫細(xì)胞分泌IL-10［12］，因此其綜合作用表現(xiàn)為輕度提升內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠血清IL-10水平。

雖然ZL-5015能提高被致死量內(nèi)毒素攻擊小鼠的存活率和延長存活時(shí)間，但存活率提高的幅度遠(yuǎn)低于地塞米松，說明其抗內(nèi)毒素的作用較弱。從時(shí)效關(guān)系的動態(tài)數(shù)據(jù)看，在內(nèi)毒素攻擊后6 h內(nèi)能抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，提高IL-10的水平，6 h后作用明顯下降，提示其作用維持時(shí)間短?？傊瑥默F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，ZL-5015本身應(yīng)用的可能性不大，但是，可以將ZL-5015作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，克服現(xiàn)有的不足，從而獲得活性更高、維持時(shí)間更長的同類化合物，用于內(nèi)毒素血癥及相關(guān)疾病的治療或輔助治療。

［1］ Cesarini S，Spallarossa A，Ranise A，et al.6-Amino-4-oxo-1，3-diphenyl-2-thioxo-1，2，3，4-tetrahydropyrimidine-5-carbonyl derivatives as a new class of potent inhibitors of interleukin-8-induced neutrophil chemotaxis［J］.Bioorg Med Chem，2009，17(10):3580-3587.

［2］ Chikhale RV，Bhole RP，Khedekar PB，et al.Synthesis and pharmacological investigation of 3-(substituted 1-phenylethanone)-4-(substituted phenyl)-1，2，3，4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylates［J］.Eur J Med Chem，2009，44(9):3645-3653.

［3］ Lokwani D，Shah R，Mokale S，et al.Development of energetic pharmacophore for the designing of 1，2，3，4-tetrahydropyrimidine derivatives as selective cyclooxygenase-2 inhibitors［J］.J Comput Aided Mol Des，2012，26(3):267-277.

［4］ Lokwani DK，Mokale SN，Shinde DB.3D QSAR studies based in silico screening of 4，5，6-triphenyl-1，2，3，4-tetrahydropyrimidine analogs for anti-inflammatory activity［J］.Eur J Med Chem，2014，73:233-242.

［5］ 張 群，周桂保，雷林生，等.1，3-二環(huán)己基-1，2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32(4):553-556.

［6］ Lun Y，Xia H，Zhang Q，et al.Anti-inflammatory and immunosuppressive activities of 1，3-dicyclopentyl-1，2，3，6-tetrahydropyrimidine-4，5-dicarboxylic acid diethyl ester(ZL-5015)［J］.Int Immunopharmacol，2013，17(2):168-177.

［7］ Zhu QH，Jiang HF，Li JH，et al.Practical synthesis and mechanistic study of polysubstituted tetrahydropyrimidines with use of domino multicomponent reactions［J］.Tetrahedron，2009，65(23):4604-4613.

［8］ 高宏富，肖光夏，袁建成.抗內(nèi)毒素研究進(jìn)展［J］.中華燒傷雜志，2005，21(5):395-398.

［9］ 孫 湛，馬小娟，姚雪萍，等.黑木耳提取物對膿毒血癥大鼠肝功能的保護(hù)作用［J］.中國病理生理雜志，2013，29(11):2072-2075.

［10］ 施孟如，南 超，徐麗艷，等.TRPV1激活對內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織炎癥損傷的影響及機(jī)制［J］.中國病理生理雜志，2013，29(12):2223-2228.

［11］ Zurita-Turk M，Del Carmen S，Santos AC，et al.Lactococcus lactis carrying the pValac DNA expression vector coding for IL-10 reduces inflammation in a murine model of experimental colitis［J］.BMC Biotechnol，2014，14:73.

［12］ Hua F，Ji L，Zhan Y，et al.Pulsed high-dose dexamethasone improves interleukin 10 secretion by CD5+B cells in patients with primary immune thrombocytopenia［J］.J Clin Immunol，2012，32(6):1233-1242.