宋璐娜　張永花　+薄紅艷　高強(qiáng)

摘 要 建立了基于目標(biāo)DNA誘導(dǎo)的發(fā)卡探針DNA轉(zhuǎn)化為G-四鏈體DNA過氧化物模擬酶的非標(biāo)記熒光增強(qiáng)型DNA檢測新體系。發(fā)卡探針DNA即分子信標(biāo)探針由兩部分構(gòu)成，環(huán)狀部分與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，莖部一端由一條富G序列構(gòu)成。無目標(biāo)DNA存在時(shí)，分子信標(biāo)處于閉合狀態(tài)，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 富G序列由于部分處于雜交狀態(tài)，無法形成G四鏈體。當(dāng)目標(biāo)DNA與發(fā)卡探針DNA雜交并打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)，富G序列解鏈并自發(fā)折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。G-四鏈體結(jié)構(gòu)與血紅素結(jié)合形成DNA模擬酶，催化H2O2還原的同時(shí)將無熒光的底物10-乙?；?3，7-二羥基吩惡嗪（ADHP）氧化成熒光產(chǎn)物。通過測量熒光信號，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的定量檢測。優(yōu)化后的體系檢測條件為pH 8.0， 10 mmol/L K+， 0.2 μmol/L Hemin， 50 μmol/L ADHP。在優(yōu)化的條件下，目標(biāo)DNA在0.005～1.0 nmol/L濃度范圍內(nèi)與體系熒光信號呈線性關(guān)系，檢出限為3.0 pmol/L。本方法可以區(qū)分完全互補(bǔ)和單堿基錯(cuò)配的目標(biāo)DNA。

關(guān)鍵詞 熒光； DNA； 發(fā)卡探針； G-四鏈體模擬酶； 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化

1 引 言

近年來，DNA檢測在臨床診斷、基因變異識別、環(huán)境監(jiān)測、食品安全以及生物學(xué)研究等領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛，顯示出良好的應(yīng)用前景，引起了研究者的廣泛關(guān)注[1]。常見的DNA檢測方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR） 法[2]、質(zhì)譜法[3]、光譜法[4]、色譜法[5]、電化學(xué)法[6]等。在光譜分析中，熒光法具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高和選擇好等優(yōu)點(diǎn)，是DNA定量檢測時(shí)應(yīng)用最廣泛的方法之一[7]。

分子信標(biāo)（Molecular beacon，MB）是一種常用的特異性檢測目標(biāo)DNA或RNA的DNA探針[8]。常規(guī)的MB莖環(huán)結(jié)構(gòu)的兩端通常需要標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在無目標(biāo)物存在時(shí)閉合形成發(fā)卡式的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，淬滅基團(tuán)通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方式淬滅發(fā)光基團(tuán)發(fā)出的熒光。當(dāng)目標(biāo)DNA與MB的環(huán)狀區(qū)特異雜交之后，閉合的莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，發(fā)光基團(tuán)因遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)出熒光，根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度來定量目標(biāo)DNA。得益于發(fā)卡狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)，基于MB的DNA檢測方法通常具有較高的選擇性和靈敏度，但標(biāo)記過程較為復(fù)雜耗時(shí)。此外，目標(biāo)DNA和MB熒光標(biāo)記分子的1∶1的比例關(guān)系也嚴(yán)重制約了基于MB方法靈敏度的提高[9]。因此，開發(fā)高靈敏度的免標(biāo)記MB逐漸引起研究者的關(guān)注[10]。

近年來，DNA過氧化物模擬酶（DNAzyme）因其表現(xiàn)出過氧化物酶的活性，且具有穩(wěn)定性好、成本低、易合成、易修飾等優(yōu)點(diǎn)而成為傳感器信號放大研究的熱點(diǎn)[11～13]。DNAzyme是富含G堿基的單鏈寡核苷酸在一定條件下折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，再與血紅素結(jié)合形成的復(fù)合物。利用DNAzyme的催化活性，可以實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的高靈敏度檢測，如金屬離子[14]、小分子[15]、蛋白質(zhì)[16]和DNA[17]等。在大部分過氧化物模擬酶催化體系中，主要采用2，2-聯(lián)氮基雙（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二銨鹽（ ABTS） 做為酶底物，通過比色法定量[18]。雖然比色分析法簡單，但檢測實(shí)際樣品時(shí)干擾較多且靈敏度較熒光法低。因而開發(fā)基于DNAzyme催化活性的熒光檢測體系逐漸引起了研究者的興趣[19]。

本研究設(shè)計(jì)了免標(biāo)記的發(fā)卡式熒光DNA分子探針，當(dāng)探針與目標(biāo)DNA特異性雜交后，發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，探針DNA的一部分會(huì)自發(fā)形成G-四鏈體，在血紅素存在時(shí)表現(xiàn)出過氧化物酶的活性。以無熒光的10-乙?；?3，7-二羥基吩惡嗪（ADHP）為模擬酶底物，利用其氧化產(chǎn)物具有熒光的性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了高靈敏的DNA檢測。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV-2400PC紫外可見分光光度計(jì)（日本島津工公司）； F-7000 熒光儀（日本日立公司）； MIR系列PCR儀（東勝創(chuàng)新公司）。

ADHP、30% H2O2、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、TritonX-100（Sigma-Aldrich公司）； 血紅素（Hemin）、二甲基亞砜（DMSO）、醋酸鉀（Alfa Aesar公司）； 實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（≥18.2 Ω·cm）。Tris-HAc（pH 8.0）緩沖液（10 mmol/L Tris，10 mmol/L HAc，0.05%（w/V）TritonX-100）。Hemin 用 DMSO 配成5 mol/L儲(chǔ)備液，-20℃暗處保存。ADHP 用DMSO配成20 mmol/L儲(chǔ)備液，冷凍保存。使用時(shí)用Tris-HAc （pH 8.0） 緩沖液稀釋到所需濃度。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將目標(biāo)DNA樣品溶液加入DNA探針溶液中，在室溫下反應(yīng)1 h，使探針發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開。加入適量Tris-HAc緩沖液（ pH 8.0 ）及血紅素，在室溫下反應(yīng)40 min，以形成DNA過氧化物模擬酶體系。然后，將ADHP和H2O2溶液加入到溶液中，室溫反應(yīng)1 h。用熒光儀測定溶液熒光，激發(fā)波長為540 nm，發(fā)射波長為581 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測原理

免標(biāo)記熒光檢測DNA的原理如圖1所示。非標(biāo)記的發(fā)卡型DNA探針的莖狀部分一端是富含G堿基的序列，與分子信標(biāo)另一端莖狀部分互補(bǔ)。

無目標(biāo)序列存在時(shí)，分子信標(biāo)處于閉合狀態(tài)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，富含G堿基的序列無法形成G-四鏈體。當(dāng)加入目標(biāo)DNA后，分子信標(biāo)環(huán)狀部分與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交導(dǎo)致發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，從而使富含G堿基的序列游離出來，在K+和Hemin作用下形成具有過氧化物酶活性的DNA模擬酶。當(dāng)加入H2O2和底物ADHP，本身不發(fā)熒光的ADHP被氧化成具有熒光的物質(zhì)，通過測量體系的熒光信號達(dá)到檢測目標(biāo)DNA的目的。這種免標(biāo)記分子信標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于不需要在DNA探針上標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，而且由于引入了過氧化物模擬酶的催化反應(yīng)，放大了信號，提高了測定靈敏度。endprint

3.2 可行性驗(yàn)證

首先，對檢測原理的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖2所示，在沒有目標(biāo)DNA 時(shí)，體系具有微弱的熒光（圖2曲線a）。由于血紅素自身具有類過氧化物酶活性，但是催化活性極低，這一微弱熒光可能來自于血紅素催化ADHP氧化為熒光產(chǎn)物。加入目標(biāo)DNA 后，體系熒光信號明顯增強(qiáng)，并且熒光強(qiáng)度隨目標(biāo)DNA的濃度的升高而增大（圖2曲線b和c），熒光信號與目標(biāo)DNA濃度具有相關(guān)性。為了證明熒光信號確實(shí)來自DNA模擬酶的催化作用，考察了溶液中沒有血紅素和沒有DNA探針時(shí)體系的熒光，結(jié)果如圖2曲線d和e所示。在沒有血紅素的情況下，體系并未表現(xiàn)出任何熒光，表明單獨(dú)存在的G-四鏈體DNA本身并不會(huì)催化ADHP氧化。當(dāng)沒有DNA探針時(shí)，體系表現(xiàn)出類似于沒有目標(biāo)DNA時(shí)的微弱的熒光，表明目標(biāo)DNA和血紅素共存物也不能有效地催化無熒光的ADHP氧化為熒光產(chǎn)物。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有在目標(biāo)DNA存在下，與探針結(jié)合打開探針DNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，探針DNA的富G部分在K+存在下折疊成G-四鏈體DNA，然后與血紅素結(jié)合形成復(fù)合物，從而表現(xiàn)出明顯的過氧化物酶活性[19]。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了提高目標(biāo)DNA檢測的靈敏度，對緩沖溶液pH值、K+濃度、血紅素的濃度以及熒光底物的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。從圖3A可見，當(dāng)緩沖溶液pH值從6.5增大到9.0，體系熒光強(qiáng)度隨著pH值的增加先增加后減少，當(dāng)pH=8.0時(shí)，熒光強(qiáng)度最大。這可能是由于溶液的pH值影響過氧化物模擬酶的活性。從圖3B和3C可見，模擬酶的催化活性受溶液中K+、Hemin濃度的影響，這主要是由于K+影響G-四鏈體的折疊，而Hemin是模擬酶催化活性的核心[15]，二者濃度都對模擬酶的活性有較大影響。當(dāng)K+濃度為10 mmol/L，Hemin濃度為0.2 μmol/L時(shí)，體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。從圖3D可見，隨著熒光底物ADHP的濃度的增加，熒光強(qiáng)度不斷增大，當(dāng)ADHP濃度為50 μmol/L時(shí)，體系熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定值。綜上所述，優(yōu)化的檢測體系溶液組成為： pH 8.0， 10 mmol/L K+， 0.2 μmol/L Hemin， 50 μmol/L ADHP。

3.4 工作曲線和檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了體系的熒光強(qiáng)度和目標(biāo)DNA濃度的關(guān)系。結(jié)果如圖4所示，熒光強(qiáng)度隨目標(biāo)DNA濃度增加而增大。熒光強(qiáng)度和目標(biāo)DNA濃度在5×10

12～1×10

9 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖4B），線性方程F=1.26+0.047c （pmol/L），相關(guān)系數(shù)r=0.954。依據(jù)信噪比為3（S/N=3），確定體系檢出限為 3.0 pmol/L。本方法對DNA的檢測限優(yōu)于文獻(xiàn)[20～24]，證明本方法具有很高的靈敏度。

3.5 方法的選擇性

發(fā)卡型DNA探針的最大特點(diǎn)在于其較高的單堿基變異區(qū)分能力。為了考察新型分子信標(biāo)探針對完全互補(bǔ)和堿基錯(cuò)配的DNA序列的區(qū)分能力，將體系用于含單堿基錯(cuò)配、兩堿基錯(cuò)配和非互補(bǔ)DNA序列的檢測，結(jié)果如圖5所示。相對于完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA序列產(chǎn)生的熒光信號，單堿基錯(cuò)配DNA只產(chǎn)生了弱的熒光信號， 兩堿基變異的DNA的熒光信號只有完全互補(bǔ)序列信號的十分之一， 非互補(bǔ)隨機(jī)序列的目標(biāo)DNA幾乎沒有引起體系熒光強(qiáng)度的變化。上述結(jié)果表明， 體系具有較高的單堿基區(qū)分能力，可以區(qū)分完全互補(bǔ)和堿基錯(cuò)配的DNA序列，具有較好的選擇性。4 結(jié) 論

建立了高靈敏度、選擇性熒光檢測DNA的體系。設(shè)計(jì)了免標(biāo)記的發(fā)卡型DNA分子探針，其特點(diǎn)在于當(dāng)DNA探針發(fā)卡結(jié)構(gòu)與目標(biāo)DNA結(jié)合而打開后，探針序列的一部分會(huì)自發(fā)形成G-四鏈體，在血紅素存在時(shí)表現(xiàn)出類過氧化物酶的活性。以無熒光的ADHP為模擬酶底物，利用其氧化產(chǎn)物具有熒光的性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了高靈敏度DNA檢測。DNA模擬酶催化反應(yīng)的引入，提高了檢測的靈敏度，具有較高的靈敏度和較低的檢出限（3.0 pmol/L）。本體系具有較好的選擇性，可以區(qū)分完全互補(bǔ)和單堿基錯(cuò)配的DNA序列。

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