張東風(fēng) ，李文棟 ，吳海萌 ，馬新勇 ，賈小忠 ，郭寶林

（1.河北省林木良種工程技術(shù)中心，河北石家莊 0 50061；2.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北石家莊050061；3.河北愛博欣農(nóng)業(yè)有限公司，河北保定071000；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保 定 0 71000；5.保定市南市區(qū)環(huán)保局，河北 保 定 0 71000；6.保定市科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)，河北保定071000）

葡萄是世界性重要果樹樹種[1]，在生產(chǎn)中占有重要位置。我國(guó)葡萄產(chǎn)量和栽培面積列居世界第5位。河北省是葡萄的主要產(chǎn)區(qū)，栽培歷史悠久，現(xiàn)有葡萄面積5萬(wàn)多公頃，產(chǎn)量近百萬(wàn)噸，面積和產(chǎn)量居全國(guó)第2位。鮮食葡萄由于其味美多汁、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有良好的保健功能，深受消費(fèi)者喜愛。發(fā)展鮮食葡萄生產(chǎn)已成為一種新型的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。

目前我國(guó)葡萄基地多集中分布于北方冬季嚴(yán)寒地帶，近年來葡萄常遭受不同程度的低溫傷害，損失嚴(yán)重。關(guān)于葡萄抗寒性的鑒定方法及抗寒生理的研究已有很多報(bào)道[2，3]。本研究以4種鮮食葡萄優(yōu)良品種為試材，對(duì)其1a生枝條進(jìn)行不同的低溫冷凍處理，測(cè)定其電導(dǎo)率并對(duì)枝條恢復(fù)性生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，旨在為鮮食葡萄的抗寒種質(zhì)篩選和抗寒栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣

選取無病蟲害的健壯葡萄植株，剪取中上部具有代表性的1a生枝條。先用自來水沖洗干凈，再用無離子水沖洗3～5次，用塑料袋和潔凈濕紗布包裹，于0℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。品種分別為：愛博欣一號(hào)、紅乳、巨峰、美人指。

儀器：Delta326型電導(dǎo)儀、XS73型電動(dòng)吸引器、BD-255LTB臥式低溫冰柜、智能光照培養(yǎng)箱（25℃，80%的光照度）、萬(wàn)分之一電子天平、101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2 研究方法

1.2.1 低溫冷凍處理及電導(dǎo)率測(cè)定

將紗布包裹的枝條分別置于0，-5，-10，-15，-20，-25，-30，-35℃8個(gè)處理的低溫冰箱中處理24h，然后再以5℃/h的速度升溫至0℃后取出枝條，在室溫下解凍1h，用濾紙吸干水分，將冷凍后的枝條剪成0.5cm小段（不含芽部分），稱取3g放于試管中，加入30mL無離子水，真空滲入10min，靜置12h左右。用Delta326型電導(dǎo)儀測(cè)定浸提液的電解質(zhì)滲出率；然后將樣品密封放入98℃烘箱中加熱1h，靜置12h左右測(cè)定浸提液的電解質(zhì)滲出率，其為細(xì)胞全部破壞后浸提液的電解質(zhì)滲出率，以代表離體枝條細(xì)胞電解質(zhì)總量。用自然條件下（0℃）的電解質(zhì)滲出率為對(duì)照，其它測(cè)定步驟相同。計(jì)算公式如下：

相對(duì)電導(dǎo)率（%）=（R1/R2）×100

其中R1為低溫處理電解質(zhì)外滲值，R2為高溫破壞后電解質(zhì)外滲值

傷害度（%）=（（R-Rck）/（100-Rck））×100 R為處理相對(duì)電導(dǎo)率，Rck為對(duì)照相對(duì)電導(dǎo)率Lt50（半致死溫度，℃）為50%傷害度時(shí)的溫度[4]。

1.2.2 恢復(fù)性生長(zhǎng)試驗(yàn)

將冷凍后的枝條在25℃的智能光照培養(yǎng)箱中水培，每天調(diào)查發(fā)芽枝數(shù)和累計(jì)發(fā)芽數(shù)，當(dāng)發(fā)芽數(shù)恒定后，計(jì)算存活枝和芽的百分率，作為枝條恢復(fù)生長(zhǎng)能力的指標(biāo)。觀察存活的枝條數(shù)及其生長(zhǎng)情況，計(jì)算生根條數(shù)和最長(zhǎng)根的長(zhǎng)度以及葉片數(shù)和最長(zhǎng)新梢的長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理各品種的電導(dǎo)率及半致死溫度的比較

電導(dǎo)率表示植物在低溫傷害下細(xì)胞質(zhì)膜透性的變化，用相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定葡萄抗寒性，能較好地反映葡萄細(xì)胞質(zhì)膜透性的變化、葡萄受傷害程度和逆境抗性的差異。此種方法是一種從細(xì)胞水平上研究逆境生理過程的有效手段之一[5]。植物細(xì)胞電解質(zhì)滲漏的多少常反映了低溫下植物受傷害的嚴(yán)重程度，抗寒性強(qiáng)的植物或受害較輕者，不僅透性增大程度較慢，而且透性的變化可以逆轉(zhuǎn)，易恢復(fù)正常。

電導(dǎo)法測(cè)定4個(gè)鮮食葡萄品種枝條的電導(dǎo)率，結(jié)果表明：在不同低溫處理下，4個(gè)品種的抗寒性存在一定差異。從圖1看出：隨溫度的降低，枝條的傷害程度加重，葡萄品種枝條的相對(duì)電導(dǎo)率越來越大，呈增加的趨勢(shì)，說明低溫處理使細(xì)胞膜受損程度加重。研究發(fā)現(xiàn)這4種葡萄品種相對(duì)電導(dǎo)率隨處理溫度的降低呈現(xiàn)慢—快—慢的增加趨勢(shì)。各品種增加的幅度有所差異，從而反映出不同品種間的抗寒性差異。愛博欣一號(hào)、巨峰的電導(dǎo)率增加比較緩慢平穩(wěn)，幅度較小，而紅乳和美人指的變化幅度較大；在-15℃時(shí)愛博欣一號(hào)、巨峰的電導(dǎo)率分別為40.1%和41.0%，差異不顯著，紅乳、美人指分別為65.65%和68.08%，差異也不顯著；愛博欣一號(hào)、巨峰從-15℃至-20℃電導(dǎo)率增長(zhǎng)迅速，分別達(dá)到56.0%和57.28%，而紅乳、美人指此時(shí)增長(zhǎng)緩慢，但二者差異極顯著。到-30℃時(shí)，愛博欣一號(hào)、紅乳、美人指間差異極顯著，紅乳與巨峰差異不顯著，所以愛博欣一號(hào)的抗寒性強(qiáng)于巨峰、紅乳和美人指；紅乳與巨峰抗寒性沒有差異（表1）。從圖1中還可以看出4個(gè)葡萄品種的變化幅度從小到大依次為愛博欣一號(hào)、巨峰、紅乳、美人指。

表1 不同溫度處理的相對(duì)電導(dǎo)率（%）及Lt50（半致死溫度，℃）

用Lt50（即半致死溫度）也可以有效的評(píng)價(jià)植物抗寒性[6]。表1表明：4個(gè)葡萄品種的半致死溫度分別是愛博欣一號(hào)-35℃、巨峰-29℃、紅乳-25℃、美人指-15℃。4個(gè)鮮食葡萄品種的半致死溫度不同，它們的大小順序是愛博欣一號(hào)（-35℃）<紅乳（-30℃）<美人指（-29℃）<巨峰（-15℃）。所以半致死溫度反映出各品種的抗寒性強(qiáng)弱依次是：愛博欣一號(hào)＞巨峰＞紅乳＞美人指。由此看出，葡萄歐美種的抗寒性強(qiáng)于歐亞種。

圖1 不同低溫處理下葡萄品種的相對(duì)電導(dǎo)率

2.2 枝條恢復(fù)性生長(zhǎng)與抗寒性

枝條恢復(fù)生長(zhǎng)法是最先采用的人工抗寒鑒定方法，是指植株或植物的某些器官進(jìn)行人工冷凍后，在一定條件下讓其恢復(fù)生長(zhǎng)，通過鑒定其恢復(fù)生長(zhǎng)的能力來鑒定其抗寒力的大小。它是建立在田間自然鑒定基礎(chǔ)之上的一種鑒定方法。因此，其鑒定結(jié)果同樣準(zhǔn)確可靠，沒有特異性，適合各種植物種類，且不需要特別復(fù)雜儀器設(shè)備，成為其他鑒定方法的對(duì)照方法[7]，因而在抗寒研究中廣泛應(yīng)用。具體方法：經(jīng)過低溫處理枝條，在培養(yǎng)箱內(nèi)水培，觀察其發(fā)芽情況，確定致死臨界溫度。

樹體在遭受凍害之后，枝條受凍害后能否存活是評(píng)價(jià)樹木傷害程度的最直接的方法。而受到凍害后能否存活，主要是通過芽對(duì)凍害的敏感性反映出來的[8]。因此，每個(gè)品種選取4個(gè)枝條，采用人工冷凍處理的方法對(duì)葡萄品種的枝條進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)恢復(fù)生長(zhǎng)后枝的成活率，成活枝的發(fā)芽率計(jì)算不同葡萄品種的抗寒性。枝條存活及發(fā)芽生長(zhǎng)情況見表2。

由表2可以看出：在0～-15℃低溫處理時(shí)，3個(gè)品種枝條的存活率均為100%；美人指枝條存活率僅25%；枝條萌芽率存在一定差異，愛博欣一號(hào)的萌芽率為100%，紅乳、巨峰品種的萌芽率均為75%，美人指的芽不萌發(fā)；-25℃處理時(shí)愛博欣一號(hào)枝條的存活率達(dá)75%，紅乳、巨峰為50%；愛博欣一號(hào)萌芽率為50%，紅乳、巨峰為25%；-30℃處理時(shí)，愛博欣一號(hào)枝條的存活率達(dá)75%，萌芽率為25%，而紅乳、巨峰的枝條變褐死亡。-35℃處理時(shí)，愛博欣一號(hào)枝條的存活率仍有25%.說明愛博欣一號(hào)抗寒性極強(qiáng)，紅乳、巨峰抗寒性居中，美人指抗寒性較差。愛博欣一號(hào)、紅乳在-15℃處理新梢有一定生長(zhǎng)，巨峰品種在-10℃處理新梢有生長(zhǎng)，美人指在-5℃處理新梢有生長(zhǎng)。

表2 不同溫度處理后枝條恢復(fù)生長(zhǎng)情況

3 討論與結(jié)論

早在1970年Lyons和Raison就提出了植物低溫傷害來自“膜脂相變”的假說。植物在低溫脅迫下，細(xì)胞膜的半透性受傷害胞內(nèi)電解質(zhì)的外滲量增加，且不同植物的細(xì)胞受害程度不同電解質(zhì)外滲量變化不一樣，所以電解質(zhì)滲出率可用于反映組織的傷害程度和植物細(xì)胞的抗性大小，常用低溫傷害前后的相對(duì)電導(dǎo)率來表示膜內(nèi)電解質(zhì)的滲透率?？购詮?qiáng)的品種電導(dǎo)率小，而抗寒性弱的品種電導(dǎo)率大，并且抗寒性較強(qiáng)者透性變化幅度越小，抗寒性弱者透性變化幅度較大[9-11]。圖1表明，隨著處理溫度的降低，傷害程度加重，葡萄品種枝條的相對(duì)電導(dǎo)率越來越大，呈增加的趨勢(shì)，低溫處理使細(xì)胞膜受損程度加重。所以根據(jù)不同的低溫處理和它們的電導(dǎo)率的變化值，這4個(gè)葡萄品種的抗寒性強(qiáng)弱順序依次為：愛博欣一號(hào)>巨峰>紅乳>美人指。

宋緒忠等人對(duì)茶樹抗寒性研究表明：植物低溫條件下受傷害的程度受到低溫持續(xù)時(shí)間、變溫強(qiáng)度及低溫溫度本身的影響，用Lt50（即半致死溫度）可以有效的評(píng)價(jià)植物抗寒性，由此得出的評(píng)價(jià)結(jié)果較為穩(wěn)定[12]。并且許多研究也表明，在研究果樹的抗寒性時(shí)用Lt50（即半致死溫度）也可以有效的評(píng)價(jià)植物抗寒性。Lt50（即半致死溫度）高，說明植物的抗寒性差，而Lt50（即半致死溫度）低，說明植物的抗寒性強(qiáng)。4個(gè)葡萄品種的半致死溫度不同，它們的大小順序是愛博欣一號(hào)（-35℃）<巨峰（-29℃）<紅乳（-25℃）<美人指（-15℃），所以抗寒性強(qiáng)弱依次為：愛博欣一號(hào)>巨峰>紅乳>美人指。

在枝條恢復(fù)性生長(zhǎng)試驗(yàn)中，通過觀察枝條的存活率、萌芽率、生根情況也可以有效的判斷其抗寒性。其測(cè)定結(jié)果和電導(dǎo)率法測(cè)定結(jié)果一致；即抗寒性強(qiáng)弱依次是：愛博欣一號(hào)>巨峰>紅乳>美人指。

綜合3個(gè)指標(biāo)來看，4個(gè)鮮食葡萄品種的抗寒性強(qiáng)弱為：愛博欣一號(hào)>巨峰>紅乳>美人指葡萄。

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