林興娥　葛宇　周兆禧　臧小平　王甲水　肖正新　馬蔚紅

摘 要 為了提取高質(zhì)量的紅毛丹基因組DNA，本研究以紅毛丹葉片為試材，比較改良CTAB法、改良SDS法和試劑盒法對(duì)紅毛丹葉片DNA的提取效果。結(jié)果表明：3種方法均可從紅毛丹葉片中提取DNA，但由于改良CTAB法通過(guò)多次洗滌，并聯(lián)合使用PVP和β-巰基乙醇處理，可有效去除紅毛丹葉片中的多糖、多酚和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，所獲得的DNA純度高且完整性較好，可用于SRAP-PCR等分子標(biāo)記分析。此結(jié)果為后續(xù)分子生物學(xué)等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 紅毛丹 ；DNA提取 ；改良CTAB法 ；SRAP

分類(lèi)號(hào) Q949.755.5

A High-quality Extraction Method for Genomic DNA of Rambutan

（Nephelium lappaceum）

LIN Xing'e1） GE Yu1） ZHOU Zhaoxi1）

ZANG Xiaoping1） WANG Jiashui1） XIAO Zhengxin2） MA Weihong1）

（1 Institute of Banana and Plantain， CATAS， Haikou， Hainan 570102；

2 Bureau of State Farm， Baoting， Hainan 572300）

Abstract To obtain high-quality rambutan gDNA used for SRAP-PCR analysis， total DNA was comparatively extracted from fresh leaves by using variant methods of the improved CTAB， improved SDS and a commercial plant genomic DNA Kit respectively. The results showed that all three methods were available for DNA extraction from rambutan leaf， but improved CTAB method by adding β-mercaptoethanol and PVP with rinse and two times washing， could effectively remove polyphenols， polysaccharides， protein and other substances of samples. The yield high-quality DNA from fresh leaves could be used for SRAP-PCR analysis.

Keywords rambutan （Nephelium lappaceum） ； DNA extraction ； improved CTAB method ； SRAP

紅毛丹（Nephelium lappaceum）屬無(wú)患子科（Sapindaceae）韶子屬（Nephelium）熱帶多年生常綠喬木植物，原產(chǎn)于馬來(lái)西亞和印度尼西亞，是著名的熱帶珍稀水果之一，與荔枝、龍眼同科，現(xiàn)廣泛分布于東南亞、中美洲等地區(qū)[1]。紅毛丹的果皮多毛，果殼含抗氧化和抗菌活性成分，果肉富含磷、鎂、硫、鈣、鋅、鐵和錳，具有極高的食用和藥用價(jià)值[2-4]。目前，紅毛丹的研究范圍主要集中在栽培、繁殖、病蟲(chóng)防治、果實(shí)采后保鮮、化學(xué)成分分離提取等應(yīng)用技術(shù)方面[5-7]，而在無(wú)性系資源評(píng)價(jià)、育種改良、基因組變異、重要性狀遺傳與分子形成機(jī)制等基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究尚未開(kāi)展。借助分子標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)基因組DNA水平的遺傳變異已成為物種進(jìn)化分析、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、分子遺傳育種等研究的重要策略。而提取高質(zhì)量的DNA是開(kāi)展相關(guān)工作的技術(shù)基礎(chǔ)。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的巨大進(jìn)步，已經(jīng)發(fā)展出許多植物DNA提取的方法，廣泛應(yīng)用的CTAB 法、SDS 法、尿素法等均通過(guò)裂解植物細(xì)胞，釋放蛋白質(zhì)等內(nèi)含物于有機(jī)溶劑中，從而使核酸分離在水相中。但由于不同物種、部位在組織結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等方面存在差異，不同方法對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的提取效果差異很大。紅毛丹的組織細(xì)胞中含有大量的多酚、多糖及其他脂類(lèi)、色素等次生代謝物質(zhì)[8-10]，采用常規(guī)方法分離出來(lái)的DNA易被多酚氧化呈現(xiàn)褐色，同時(shí)由于DNA溶液粘稠，采用多次酚-氯仿抽提也不能得到高質(zhì)量的DNA，并且在多次抽提過(guò)程中易受機(jī)械剪切作用而發(fā)生降解，不能作為PCR模板進(jìn)一步分析使用。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比改良CTAB法、改良SDS法和商品化試劑盒3種方法的提取效果，旨在選擇一種簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)的高質(zhì)量紅毛丹基因組DNA提取方法，為進(jìn)一步開(kāi)展紅毛丹SRAP等分子標(biāo)記方面的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料均取自海南省保亭熱作所紅毛丹種質(zhì)資源圃，采集無(wú)病蟲(chóng)害的葉片放入冰壺中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。本研究隨機(jī)選取3個(gè)樣品作為試驗(yàn)材料，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 改良CTAB法

改良CTAB法參照李明芳等[11]的方法，在葉片研磨時(shí)預(yù)先加入PVP粉末，研磨成粉末后加入2×CTAB提取液和β-巰基乙醇，離心取上清后分別用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶異戊醇（24∶1）進(jìn)行振蕩抽提DNA。具體操作方法為：稱(chēng)取幼嫩葉片0.2 g，加入0.03 g PVP和液氮磨成細(xì)粉，然后轉(zhuǎn)入2.0 mL預(yù)冷凍離心管中，再加入800 μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取液[2%（m/V）CTAB，100 mmol/L Tris·HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%（m/V）PVP，pH調(diào)至8.0]和20 μL β-巰基乙醇充分混勻，65℃溫浴30 min，期間輕搖2次；水浴完成后離心（15℃，12 000 r/min）15 min取上清液，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提上清液，顛倒使之充分混勻，離心（4℃，12 000 r/min）15 min取上清；再加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提1次，顛倒混勻，離心（4℃，12 000 r/min）15 min取上清；加入等體積的異丙醇，混勻后可見(jiàn)絲狀或絮狀沉淀，即為DNA粗提物，用70%乙醇洗滌3遍，吹干；加入100 μL超純水溶解DNA，再加入0.5 μL RNase A液（10 mg/mL），37℃水浴消化30 min，最后將獲得的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.2 改良SDS法

改良SDS法參照曹輝慶等[12]的方法，在葉片研磨時(shí)預(yù)先加入PVP粉末，研磨至粉末后加入SDS提取緩沖液和β-巰基乙醇，離心取上清后分別用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶異戊醇（24∶1）進(jìn)行振蕩抽提DNA。具體操作方法為：稱(chēng)取幼嫩葉片0.2 g，加入0.03 g PVP和液氮磨成細(xì)粉，然后轉(zhuǎn)入2.0 mL預(yù)冷凍離心管中，再加入800 μL 65℃預(yù)熱的SDS提取緩沖液[100 mmol/L Tris·HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA（pH 8.0），500 mmol/L NaCl，2%（m/V）PVP，2% SDS溶液（m/V）]和20 μL β-巰基乙醇充分混勻，65℃溫浴30 min，期間輕搖2次；水浴后離心（15℃，12 000 r/min）15 min，取上清液，后續(xù)操作同1.2.1。

1.2.3 試劑盒法

稱(chēng)取幼嫩葉片0.2 g，加入液氮充分研磨，用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的DNA secure plant Kit （D2485-01）新型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，具體操作見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 DNA質(zhì)量檢測(cè)

取DNA樣品5 μL 用ddH2O稀釋混勻20倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD230nm、OD260nm、OD280nm值。根據(jù)OD260nm值估測(cè)其濃度，根據(jù)OD260nm/OD280nm值和OD260nm/OD230nm值估測(cè)其純度。DNA濃度=OD260nm×測(cè)定樣品體積×稀釋倍數(shù)；DNA得率=DNA濃度×總樣品體積/樣品鮮重。

取 DNA樣品8 μL，加入3 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液，用1%瓊脂糖凝膠電泳120 V電泳18 min后拍照，判斷DNA的質(zhì)量和完整性。

1.2.5 SRAP分子標(biāo)記驗(yàn)證提取效果

以3種提取方法獲得的樣品DNA為模板，采用引物組合ME5/EM3進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)3種DNA提取方法的效果。SRAP-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中含DNA模板20 ng、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.4 μmol/L、rTaq酶0.8 U、Mg2+ 2.0 mmol/L。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸70 s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸70 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，染色后在紫外凝膠成像儀上觀(guān)察并拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法所得DNA的純度和得率

用紫外分光光度法測(cè)定DNA純度時(shí)，一般情況下，若1.9>OD260nm/OD280nm值>1.8時(shí)，說(shuō)明該DNA樣品受雜質(zhì)污染最少，質(zhì)量最佳；若OD260nm/OD280nm>1.9時(shí)，表明DNA樣品可能受到少量RNA的污染；如果其比值小于1.8，則說(shuō)明有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)存在[13]。由表1可知，改良CTAB法提取出的DNA質(zhì)量較好，純度較高，雜質(zhì)量少，說(shuō)明DNA樣品中的蛋白質(zhì)、酚類(lèi)和多糖去除充分，較好地避免了RNA污染，可很好的滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求；改良SDS法提取得到的DNA呈褐色，含有較多的蛋白質(zhì)、酚類(lèi)和多糖等雜質(zhì)，純度較低；試劑盒法提取DNA得率最低，這是由于紅毛丹葉片含有豐富的多糖，提取過(guò)程中多糖很容易形成粘稠的膠狀物質(zhì)，難于溶解，堵塞柱子造成DNA得率低。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳

從圖1可知，3種方法均能從紅毛丹的葉片中提取出完整的DNA，其大小均在4.5 kb以上。但改良SDS法提取的DNA量相對(duì)較少，同時(shí)含有膠狀粘稠雜質(zhì)，提取效果的穩(wěn)定性差；而采用改良CTAB法提取的DNA量明顯高于改良SDS法，其電泳條帶明顯比改良SDS法的亮，提取效果的穩(wěn)定性好；試劑盒提取3個(gè)材料DNA所得的效果并不相同，有些材料的DNA條帶較亮，有些較暗，條帶亮度與DNA產(chǎn)量呈正相關(guān)，少數(shù)點(diǎn)樣孔存在微弱熒光，表明有蛋白質(zhì)污染，還存在少量RNA污染，這可能是加入RNase A量不足或37℃水浴消化時(shí)間過(guò)短造成。綜合考慮，改良CTAB法可較好的去除蛋白質(zhì)和多糖，DNA質(zhì)量較好，最適于紅毛丹成熟和幼嫩葉片基因組DNA的提取。

2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)改良CTAB法、改良SDS法和試劑盒法提取的DNA質(zhì)量對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，分別以3種提取方法獲得的DNA為模板，對(duì)其進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增檢測(cè)。由圖2可知，改良CTAB法提取的DNA模板均可擴(kuò)增出比較清晰的條帶，且穩(wěn)定性好；試劑盒法提取的DNA純度高，但不同背景的植物材料差別較大，SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性較差；而改良SDS法提取的DNA未成功擴(kuò)增出清晰的SRAP條帶，可能含有較多的蛋白質(zhì)、糖、色素等反應(yīng)抑制物。綜上所述，改良CTAB法提取的紅毛丹基因組DNA純度高，雜質(zhì)去除充分，通用性好，完全可滿(mǎn)足SRAP等分子標(biāo)記分析的需要。

3 討論與結(jié)論

目前，關(guān)于去除荔枝、龍眼組織中多糖、多酚、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的研究報(bào)道較多。如易干軍等[14]比較了傳統(tǒng)SDS法和CTAB法提取荔枝基因組DNA的效果，結(jié)果表明2種方法均不適宜荔枝DNA的提取；分別在CTAB緩沖液中加入50 mmol/L的β-巰基乙醇、5%PVP和10 mmol/L Na2S2O5，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入10 mmol/L Na2S2O5提取的DNA質(zhì)量較好。劉鍇棟等[15]采用改良2×CTAB法即在緩沖液中加入β-巰基乙醇和PVP，且把溫浴時(shí)間延長(zhǎng)至2 h，可有效去除野生龍眼葉片中大部分多糖、多酚、單寧、色素等物質(zhì)，提取到的DNA呈乳白色絮狀沉淀，質(zhì)量較高。肖璇等[16]采用改良的CTAB法和SDS法，即在核裂解之前先破碎細(xì)胞，將存在于細(xì)胞質(zhì)中的次生物質(zhì)去除后再裂解細(xì)胞核，細(xì)胞核裂解后用氯仿/異戊醇連續(xù)抽提2次以上，去除了大部分蛋白和色素，同時(shí)將CTAB濃度提高到3%（m/V），增強(qiáng)了裂解細(xì)胞和去雜質(zhì)的能力，在改良SDS法中異丙醇沉淀前加入1/5體積的5 mol/L NaCl，進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片及其他雜質(zhì)，提取到的DNA純度高。目前關(guān)于紅毛丹DNA提取的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)在參考前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合紅毛丹的特性，主要通過(guò)預(yù)先在材料中加入PVP粉末再進(jìn)行研磨，然后轉(zhuǎn)入含2%（V/V）β-巰基乙醇和2%（m/V）PVP的提取液中，無(wú)論材料的老嫩程度，均可有效防止褐變及多糖形成的膠狀物質(zhì)。改良CTAB法較改良SDS法提取到的DNA純度更高，呈乳白色，可有效去除色素。通過(guò)PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取的DNA可用于后續(xù)研究。

從本試驗(yàn)結(jié)果可看出，不同的紅毛丹品系間得到的DNA純度和產(chǎn)率不一致，可能是由于不同紅毛丹品種中多糖和酚類(lèi)的組成和含量具有一定的差異。植物組織中多酚、多糖等代謝物質(zhì)隨著組織器官的成熟而增加[16-19]，因此，在改良CTAB法的基礎(chǔ)上，還需根據(jù)紅毛丹不同的品系、取材部位、發(fā)育程度及試驗(yàn)要求等進(jìn)一步調(diào)節(jié)試驗(yàn)成分的組成，以便探索一種更好的操作方法，最終得到更高質(zhì)量的DNA。

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