李培林等

摘 要：口蹄疫滅活疫苗目前仍然是控制口蹄疫的主要手段，隨著懸浮工藝和純化工藝的改進，使口蹄疫滅活疫苗的質(zhì)量有很大的提高。探討了細胞狀態(tài)、接毒量和毒液保存條件對種毒質(zhì)量的影響。結(jié)果表明，細胞狀態(tài)影響收毒時間的變化，同時一定程度上也影響LD50的變化；接毒含量增高，收獲時間縮短，而低劑量、正常劑量接毒傳代試驗均能獲得合格的種毒支系，適宜的改變接毒量有助于提高種毒質(zhì)量；不論是4 ℃冷藏保存還是-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價均有不同程度的損失，而且4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式。

關(guān)鍵詞：BHK-21細胞；口蹄疫滅活疫苗；種毒制備；質(zhì)量控制

中圖分類號：S852.659.6 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2015）07-0007-03

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴重危害畜牧業(yè)的發(fā)展[1，2]。OIE將該病列為A類家畜傳染病之首，而我國農(nóng)業(yè)部也把該病列為第一類防控疫病。對于口蹄疫的防控，目前仍以滅活疫苗為主。此項措施在我國重大疫情中發(fā)揮巨大防治作用。

對于口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)，質(zhì)量的提高，產(chǎn)品創(chuàng)新以及員工素質(zhì)提高是企業(yè)發(fā)展的動力。因此，疫苗質(zhì)量的提高離不開工藝革新以及基礎(chǔ)方面的優(yōu)化研究。工藝革新是疫苗制備企業(yè)的硬件系統(tǒng)，由企業(yè)的綜合實力決定。而基礎(chǔ)研究主要包括：種細胞的馴化與篩選、種毒的優(yōu)化制備及抗原純化等相關(guān)研究[3，4]。從種毒制備人員的自身素質(zhì)講，篩選制備出良好的種毒，不僅給疫苗前端解決了問題，而且也給后端工藝帶來可喜的成果。因為種毒質(zhì)量好壞、抗原含量高低，直接影響口蹄疫抗原中的有效成分，而且關(guān)系到疫苗的免疫效果。在生產(chǎn)中獲得一支理想的種毒支系，不僅給生產(chǎn)人員帶來方便，而且也給企業(yè)帶來很大的經(jīng)濟收益。因此，制苗毒株的選擇及質(zhì)量的提高是疫苗生產(chǎn)的首要問題[6]。

篩選優(yōu)質(zhì)的種毒需要有正確的操作方法更需要掌握影響種毒質(zhì)量的一些因素。目前，影響貼壁種毒因素主要有細胞貼壁狀態(tài)、維持液的酸堿度、接毒量、最佳收獲時間、檢驗周期、種毒保存時間以及種毒傳代路線及無菌觀念等。因此，本次試驗主要探討影響種毒質(zhì)量的一些因素，并進行分析與總結(jié)，從而通過過程控制，調(diào)整傳代條件、保存方法，篩選出毒價穩(wěn)定、146S高的基礎(chǔ)種毒，從而保障種毒質(zhì)量，提高企業(yè)競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（Thermo 8000WJ）；生物安全柜（HFsafe-1200型）；倒置顯微鏡清（OLMPUS）；4 ℃平溫冰箱；-20 ℃臥式冷凍冰柜；溫室、生物細胞轉(zhuǎn)瓶機、細胞觀察臺；超低溫冰箱（Thermo ULT1386-3-V41）、移液器、恒溫震蕩培養(yǎng)箱等儀器。

1.1.2 BHK-21細胞 由金宇保靈生物藥品有限公司提供，分種傳代一般按1∶3～1∶4進行操作，加入營養(yǎng)液，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。營養(yǎng)液配制按本公司的配液SOP進行操作。

1.1.3 O型口蹄疫基礎(chǔ)種毒 由金宇保靈生物藥品有限公司質(zhì)量檢驗部提供FMDV基礎(chǔ)種毒。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細胞貼壁狀態(tài)對種毒的影響 按常規(guī)細胞傳代的方法，將細胞復(fù)蘇傳代后，將同批培養(yǎng)24、48、53、72、96 h細胞，每瓶細胞換液，加入病毒維持液100 mL，同時每個培養(yǎng)時間設(shè)兩個重復(fù)，分別按5%～8%的接毒量接毒，接毒完成后置CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)6～8 h觀察，病變達到90%時收獲病毒冷凍保存后混勻測病毒含量（取平均值）。

1.2.2 改變接種比例對篩選種毒的影響 選同批48 、72 h培養(yǎng)階段的BHK-21細胞，細胞換液，加病毒維持液100 mL，一組以7%～8%的接毒量接毒，另一組以1%接毒量接毒，置CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)6～8 h觀察，病變達到90%時收獲病毒冷凍保存后混勻測病毒含量，連續(xù)傳代3次。

1.2.3 不同保存方式對種毒質(zhì)量的影響 通過測毒結(jié)果篩選出毒價高和毒價低的種毒，然后分別將上述兩種種毒，進行4 ℃和-20 ℃冷凍保存，保存期限為210 d，經(jīng)過測毒結(jié)果分析計算不同時間毒價的損失率，毒價損失率=原樣毒價-不同時間段的毒價/原樣毒價，記錄結(jié)果。

1.2.4 LD50測定 用pH為7.6～7.8的細胞維持液將待測各批次種毒樣品進行10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-9 3個稀釋度，每個稀釋度頸背部皮下接種2～3日齡乳鼠4只，設(shè)對照2只，每只注射0.2 mL，接種后觀察7 d，根據(jù)發(fā)病死亡乳鼠數(shù)按Reed-Muench法計算LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 BHK-21細胞貼壁狀態(tài)對種毒因素的影響

由表1、圖1可知，隨著BHK-21細胞培養(yǎng)時間的延長，即細胞從24 h到96 h 的過程中，細胞表現(xiàn)基本形成單層、致密單層、脫落等現(xiàn)象的發(fā)生。因此，選擇不同培養(yǎng)時間段的細胞，對篩選種毒支系有一定的影響，從上述數(shù)據(jù)分析可知，細胞培養(yǎng)時間與收毒時間存在一定的相關(guān)性，從LD50毒價（LD50的值為10N LD50/0.2 mL中N的值，下同）分析可知，毒價上升的階段對應(yīng)的是細胞48～72 h培養(yǎng)階段。

2.2 改變接種比例對篩選種毒的影響

從表2可知，按7%～8%種毒含量，連續(xù)傳3代，種毒LD50基本在7.5～8.0范圍內(nèi)變化，說明按7%～8%正常含量接毒，可以得到理想的種毒支系。而且可以保證抗原的正常生產(chǎn)。從收毒時間分析，隨著代次的增加收毒時間逐漸在縮短，而細胞顆粒飽滿時間基本穩(wěn)定在8.5～11.5 h范圍內(nèi)。

從表3低劑量組數(shù)據(jù)分析可知，以1%種毒含量進行接毒傳代，種毒LD50在7.0～8.0范圍內(nèi)變化，而且通過收毒時的觀察，SY001F10代毒價不合格，通過后續(xù)連續(xù)傳代，收毒時間縮短毒價升高，可以初步證明，用低劑量接毒方法可以盲傳兩到三代，毒價基本趨于合格。說明這種傳代方法，可以達到生產(chǎn)的要求，而且這種工藝有一定的可行性。經(jīng)表2與表3對比分析可知，正常劑量組與低劑量組種毒傳代方式最大的不同，種毒含量高收毒時間快，種毒含量低收毒時間慢，即種毒含量的多少與收毒時間呈一代的正相關(guān)性，測毒結(jié)果與細胞病變情況，兩種方式基本一致。

2.3 貼壁種毒不同保存方式對種毒質(zhì)量的影響

從表4、圖2可知，不論是4 ℃保存和還是

-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價均有不同程度的損失，從保存條件分析，4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式。從毒價高低分析可知，在大部分保存時間內(nèi)，在4 ℃保存高毒價的下降率明顯低于4 ℃保存低毒價的下降率，而-20 ℃保存方式也有上述規(guī)律，這就說明，保存方式和毒價高低影響貼壁種毒的質(zhì)量。

3 討論

3.1 BHK-21細胞貼壁狀態(tài)及傳代穩(wěn)定性對篩選種毒質(zhì)量的影響

細胞培養(yǎng)時間、分種比例、細胞營養(yǎng)液以及不同種類的血清與添加量，均能影響貼壁細胞狀態(tài)與形態(tài)。而本次試驗在固定分種比例、營養(yǎng)液以及血清因素同時，只考慮細胞培養(yǎng)時間對篩選種毒支系的影響，旨在探討細胞培養(yǎng)時間與種毒質(zhì)量的關(guān)聯(lián)性。在實際工作中，細胞狀態(tài)是指細胞的致密程度、融合率及細胞肉眼觀察情況。細胞狀態(tài)影響收毒時間的變化，同時也一定程度上影響LD50毒價的變化。一般情況，不同培養(yǎng)階段BHK-21細胞，細胞的致密度與薄厚度不一致，在接毒量一致的情況下，細胞培養(yǎng)時間會影響CPE收獲時間，從而間接的影響毒價。在實際工作中，盡量選擇細胞形態(tài)好，培養(yǎng)時間在48～72 h細胞進行接毒，同時在工作中加無菌觀念意識，在一定程度上，利于篩選優(yōu)質(zhì)的種毒。

3.2 不同的接種比例對篩選種毒的影響

在細胞狀態(tài)良好，細胞培養(yǎng)時間一定的情況下，貼壁種毒接毒含量增高，收獲變時間縮短，反之亦然。經(jīng)報道，接毒量高低直接影響病毒繁殖周期，細胞病變快慢直接影響細胞維持液的酸堿度及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗快慢，這些因素的變化會直接影響完整病毒粒子的情況。通過本次試驗結(jié)果可知，低劑量、正常劑量接毒傳代試驗均能獲得合格的種毒支系。因此，在實踐中，適宜的改變接毒量有助于提高種毒毒價。所以，在種毒傳代中多注意上述問題。

3.3 貼壁病毒液的不同保存條件對種毒質(zhì)量的因素的影響

在口蹄疫滅活疫苗制備過程中，不可避免的要將基礎(chǔ)種毒、抗原滅活液、成品苗進行保存，選擇適宜的保存條件和儲備方法，對疫苗質(zhì)量的提高有一定的指導(dǎo)意義。大量資料報道表明[5]，冷鏈系統(tǒng)是口蹄疫苗的主要儲存和運輸方式，可見如何有效的保存疫苗終端產(chǎn)品也是疫苗質(zhì)量提高的關(guān)鍵。本次試驗證明，不論是4 ℃平穩(wěn)保存和還是-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價勻有不同程度的損失，而且4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式，本次結(jié)果與一些報道有所差距。經(jīng)查閱資料分析有如下原因所致，因為在保存口蹄疫抗原或毒液時，大部分采用的是緩沖體系來保存，在4 ℃或-20 ℃保存條件下，-20 ℃保存條件下更容易使緩沖體系酸堿度發(fā)生變化，從而使毒液中的完整病毒粒子更容易降解，影響口蹄疫病毒質(zhì)量。

疫苗制備過程是一個系統(tǒng)過程，此次試驗只是從種毒方面進行了初步探討，細胞培養(yǎng)時間的變化、接毒量的變化以及毒液保存條件的改變對貼壁種毒質(zhì)量的影響。因此，在實際工作中細化深入的研究，對口蹄疫疫苗質(zhì)量的提高會有一定的指導(dǎo)意義。

參考文獻：

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[5] ALLENDE R M. South American standards for Foot-and-mouth disease vaccine quality[J]. Foot-and-mouth Disease： Control Strategies， 2003，10：331-336.

[6] 王永錄，張永光.口蹄疫A型滅活疫苗毒種和種子批的研究[J]中國獸醫(yī)科學，2006，36（5）：371-375.