夏新奎　郭亞瓊等

摘要：為了考察影響貓爪草綜合提取工藝的各因素，確定貓爪草綜合提取最佳工藝條件，在前期單因素考察的基礎(chǔ)上，以浸提溫度、超聲頻率、超聲時間和固液比為考察因素，以貓爪草干膏率和多糖提取率為考察指標，采用正交試驗設(shè)計考察貓爪草最佳提取工藝。結(jié)果表明，貓爪草最佳提取工藝為浸提溫度50 ℃，超聲頻率40 kHz，每次超聲20 min，固液比1∶30。在此條件下，貓爪草干膏率為38.90%，多糖提取率為32.71%。

關(guān)鍵詞：貓爪草；綜合提?。怀暭夹g(shù)；正交試驗

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3720-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.036

Abstract： To establish the optimal integrated extraction process of Radix Ranunculi Ternati， orthogonal design experiment， based on single factor test，was carried out， taking the dry extract yield and the polysaccharide extraction rate as comprehensive evaluation indicator， and the temperature of extraction solvent， ultrasonic frequency，ultrasonic time and the proportion of herbs and extraction solvent as investigation factors. The results showed that the optimum extraction process conditions were as follows：the temperature of extraction solvent and ultrasonic medium was 50 ℃； the ultrasonic frequency was 40 kHz； the ultrasonic time was 20 min each time； and the proportion of herbs and extraction solvent was 1∶30. Under this condition， the dry extract yield of Radix Ranunculi Ternati was 38.90% and the polysaccharide extraction rate was 32.71%.

Key words： Radix Ranunculi Ternati； integrated extraction； ultrasonic extraction technology； orthogonal test

貓爪草系毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）的干燥塊根。河南省信陽地區(qū)既是貓爪草的發(fā)現(xiàn)地和野生分布區(qū)，又是目前國內(nèi)貓爪草的主要栽培區(qū)，貓爪草已是信陽市乃至河南省又一味道地藥材。貓爪草性溫，味甘、辛，歸肝、肺經(jīng)，具有化痰散結(jié)、解毒消腫的功效，用于治療瘰疬痰核，疔瘡腫毒，蛇蟲咬傷[1]。貓爪草的化學成分主要有糖類、黃酮類與苷類、氨基酸、生物堿苷類、有機酸、甾醇及酯、揮發(fā)油和微量元素，貓爪草的藥理作用主要有抗結(jié)核、抗菌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)作用、保護性抑制作用、抗氧化作用等[2]。貓爪草已成為國家重點發(fā)展的三類藥材之一[3]。現(xiàn)代藥理研究[4，5]證明，貓爪草多糖（RTP）及其皂苷（RRTS）均具有興奮免疫活性作用，也是其重要的抗腫瘤活性成分，RTP具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用和抗氧化作用[5]，貓爪草皂苷對多種癌癥[4，6-8]均有抑制作用。貓爪草的水煎液[9]、有機酸部位[10]、醇提物[11]、小毛茛內(nèi)酯[12]等均具有抗結(jié)核作用。目前貓爪草提取方面的研究多停留在對貓爪草多糖[13，14]、小毛茛內(nèi)酯[15]等有效部位的提取工藝研究，舍棄了其他有價值的成分，不利于貓爪草的綜合利用；且在上述提取過程中使用了石油醚、乙醚[13，14]等有機溶劑，不適合綜合生產(chǎn)。目前尚未見對其有效成分綜合提取的研究報道，因此很有必要對貓爪草進行綜合提取，最大限度地保留其有效成分，發(fā)揮其綜合療效；或者將其不同有效成分單獨分離純化，滿足臨床的不同需求。本研究以浸提溫度、超聲頻率、超聲時間、固液比為考察因素，由于多糖含量較高且作用顯著，故以貓爪草干膏率和多糖提取率為指標，以期為充分利用貓爪草的產(chǎn)地資源，對貓爪草進行綜合提取研究，將貓爪草就地轉(zhuǎn)化成附加值較高的貓爪草總皂苷、有機酸、多糖或總提取物提供依據(jù)，一方面可滿足臨床治療的不同需求，另一方面也可減少營運成本，增加貓爪草收益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 貓爪草藥材購自河南淮濱縣王崗鄉(xiāng)毛莊村，由楊俊杰老師（信陽農(nóng)林學院，中藥專業(yè)，副教授）鑒定。無水葡萄糖標準品（中國計量科學研究院，批號為GBW1006213001，含量為99.6%）、蒽酮、硫酸、乙醇等均為分析純，純化水自制。

1.1.2 儀器 751G型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；DL-5型離心機（上海安亭科學儀器廠）；電磁爐（美的集團）；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；水循環(huán)恒溫水浴箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；AB-135-S型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；PB602-S電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；101AS-2電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器有限公司）；SCQ-8201E超聲清洗儀（上海聲彥超聲波儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材處理

將貓爪草挑揀、淘洗后，105 ℃烘干，粉碎成60目，備用。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制備 ①葡萄糖標準溶液的配制。精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品25.4 mg于250 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得葡萄糖濃度為101.6 μg/mL的對照品溶液。②標準曲線的制備。精密量取上述葡萄糖標準溶液0.4，0.8，1.0，1.2，1.5，2.0 mL于6只干燥的10 mL容量瓶中，加純化水至2 mL，迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加100 mL硫酸溶解，搖勻，即得），室溫放置15 min后，立即置于冰浴中冷卻15 min，取出，以不加葡萄糖的溶液作為空白對照，采用紫外-可見分光光度法[1]，在625 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標得標準曲線A=0.010 454C+0.006 820（r=0.999 3），結(jié)果表明葡萄糖在5.08～25.40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 貓爪草干膏率和多糖含量的測定 ①貓爪草干膏率的測定。精密稱取貓爪草浸膏，置于干燥的蒸發(fā)皿中，按《中華人民共和國藥典》[1]水分測定法（附錄IX H）第一法（烘干法）測定，計算干膏率。②貓爪草多糖含量的測定。采用蒽酮-硫酸法測定，參照《中華人民共和國藥典（第二增補本）》[16]靈芝多糖含量測定項下方法測定貓爪草多糖。準確稱取貓爪草干浸膏（濕膏折算成干膏）0.15 g，置25 mL容量瓶中，加純化水超聲溶解并稀釋至刻度。過濾，精密移取濾液10 mL置于小燒杯中水浴蒸干，加1 mL純化水超聲使其溶解，加無水乙醇10 mL，放置30 min，2 000 r/min離心5 min，沉淀物用熱純化水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，放冷，加純化水至刻度，搖勻。取溶液適量，離心，精密量取上清液1 mL置于50 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度。按照“1.3.2”中“②”的方法測定吸光度，計算，即得。

1.3.3 貓爪草綜合提取工藝的正交試驗 準確稱取貓爪草60目藥粉100 g，將浸提溶劑加熱至規(guī)定溫度，首次浸泡時間為30 min。依據(jù)貓爪草綜合提取單因素試驗結(jié)果，將以下因素列為固定條件：超聲介質(zhì)溫度為60 ℃，超聲功率300 W，總提取次數(shù)3次，第一次提取溶劑為95%乙醇，第二次提取溶劑為70%乙醇，第三次提取溶劑為飲用水。提取效率以貓爪草干膏率、多糖提取率進行綜合評分，提取效率滿分為1.0，貓爪草干膏率、多糖提取率滿分分別為0.5。把對提取效率影響較大的因素浸提溫度（A）、超聲頻率（B）、超聲時間（C）、固液比（D）作為考察因素，采用正交表L9（34）進行試驗，確定貓爪草綜合提取最佳工藝條件，因素與水平見表1。其中固液比是指貓爪草質(zhì)量（g）與提取溶劑總用量（mL）的比值，且3種提取溶劑用量相同；超聲時間指3種提取溶劑提取的總時間，各溶劑提取時間相同。

2 結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由表2和表3可知，貓爪草綜合提取中各因素對貓爪草干膏率、多糖提取率影響的主次順序為A、B、C、D，即浸提溫度為主要影響因素，其次是超聲頻率，固液比影響最小。確定的最佳提取工藝為A1B2C1D2，即浸提溫度為50 ℃，超聲頻率為40 kHz，超聲時間為60 min，固液比為1∶30。驗證試驗結(jié)果表明，在該條件下，貓爪草干膏率分別為38.60%、39.28%、38.83%，平均干膏率38.90%；貓爪草多糖提取率分別為33.01%、32.49%、32.62%，平均多糖提取率為32.71%，高于正交表中任何一組的試驗結(jié)果。是惟一國家藥品標準品種貓爪草膠囊干膏率的4.4倍，提取時間也減少了1.5 h。

3 討論

目前有關(guān)貓爪草提取方面的研究還不夠深入，比如貓爪草有機酸的提取[10]、貓爪草總皂苷的提取[8]均沒有進行工藝優(yōu)化；另外有關(guān)貓爪草有效成分含量的測定報道較少，測定方法也不固定，比如貓爪草多糖的測定有采用苯酚-硫酸法的[13，14]，也有采用蒽酮-硫酸法的[17]，應(yīng)考察兩種方法對貓爪草多糖測定結(jié)果的影響；目前貓爪草總皂苷尚無含量測定方面的報道。

本試驗采用蒽酮-硫酸法測定貓爪草多糖，在操作中發(fā)現(xiàn)有很多因素對貓爪草多糖測定結(jié)果有影響，比如顯色的時間、溫度、操作的快慢等對測定結(jié)果均有不同程度的影響，且操作費時、繁瑣，應(yīng)在以后的研究中探索出更為便捷、靈敏的貓爪草多糖測定方法。

在本試驗的基礎(chǔ)上，還可以對兩次醇提、一次水提的結(jié)果分別進行考察，把皂苷、有機酸、內(nèi)酯提取率也納入考察范圍，比如醇提取的影響因素試驗和水提取的影響因素試驗可分別進行，這有待進一步探討。

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