尹柏雙　王秋竹　付連軍等

摘要：為研究不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病與乳清中淀粉樣蛋白A（SAA）含量變化的關(guān)系。選取8頭健康奶牛和24頭患輕、中、重度隱性乳房炎奶牛為試驗(yàn)動(dòng)物，采集乳樣，分離乳清，利用Elisa SAA檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中SAA含量。結(jié)果表明，隨著隱性乳房炎病情加重，乳汁體細(xì)胞數(shù)的增加，乳清中SAA含量逐漸升高，與健康對(duì)照組相比差異呈顯著或極顯著（P﹤0.01或P﹤0.05）。結(jié)果表明，乳清中SAA含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關(guān)性，乳腺損傷程度和乳汁體細(xì)胞數(shù)增加與乳清中SAA含量呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：奶牛；隱性乳房炎；乳清；淀粉樣蛋白

中圖分類號(hào)：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）15-3705-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.032

Abstract： In order to study on relationship recessive mastitis of dairy cows with amyloid protein A in the whey. 8 healthy cows and 24 cows with light， moderate， severe recessive mastitis were randomly divided into 4 groups. To collect milk and separate whey， SAA content was detected by Elisa SAA kit. The results showed that the content of the SAA in whey was increased significantly with the aggravation of recessive mastitis， increase the milk somatic cell count， compared with the healthy control group（P﹤0.01 or P﹤0.05）. The results indicated that the change of the SAA content in whey with recessive mastitis incidence has certain correlation， degree of breast injury and increase of milk somatic cell counts were positively correlated with the SAA content in whey.

Key words： cows； recessive mastitis； whey； amyloid protein

奶牛隱性乳房炎可引起奶牛產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)降低，養(yǎng)殖成本增加，產(chǎn)后發(fā)情延長(zhǎng)，妊娠時(shí)間推遲，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一[1]。血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A，SAA）是一類多基因編碼的多形態(tài)蛋白家族，屬于急性期反應(yīng)蛋白，炎癥或感染急性期SAA迅速升高，在疾病的恢復(fù)期迅速下降[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)，SAA在細(xì)菌感染時(shí)升高[4]；在微弱的炎癥刺激時(shí)SAA可作為輕微炎癥刺激的判定指標(biāo)[5]。奶牛隱性乳房炎發(fā)病與微生物感染、機(jī)械性和物理性損傷引起的乳腺炎性反應(yīng)密切相關(guān)，本試驗(yàn)研究乳清中SAA與不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病的關(guān)系，為隱性乳房炎快速診斷方法的建立提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 通過(guò)乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)后將年齡、胎次、產(chǎn)奶量、泌乳期等指標(biāo)相近的健康奶牛8只和患不同程度奶牛隱性乳房炎奶牛24只，由吉林市某奶牛場(chǎng)提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 淀粉樣蛋白A（SAA）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物試劑研究所；Fossmatic 5000型體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（FOSS 公司，丹麥）；Varioskan 酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)）；離心機(jī)（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 通過(guò)乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)后將試驗(yàn)?zāi)膛７殖山】祵?duì)照組（8只，SCC﹤10×104 個(gè)/mL）、輕度隱性乳房炎組（8只，50×104個(gè)/mL﹤SCC﹤150×104個(gè)/mL）、中度隱性乳房炎組（8只，150×104個(gè)/mL﹤SCC﹤500×104個(gè)/mL）、重度隱性乳房炎組（8只，SCC>500×104個(gè)/mL）。

1.2.2 乳樣采集 采集試驗(yàn)?zāi)膛５娜橹蓸忧皩?duì)乳區(qū)進(jìn)行清洗，然后用70%的酒精消毒乳區(qū)，棄掉頭3 把乳汁，分別采乳10 mL裝入無(wú)菌試管中，將采集的乳樣放到冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2.3 乳清制備 將采集的乳樣3 000 r/min離心5 min，除去上層乳脂，然后于16 000 r/min高速離心機(jī)中離心10 min，去除沉淀，保留上清液，4 ℃保存，待測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)方法 乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)采用體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定，淀粉樣蛋白A（SAA）含量采用SAA Elisa試劑盒測(cè)定，在酶標(biāo)儀上450 nm 比色測(cè)定OD值，根據(jù)試劑盒說(shuō)明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算SAA含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)做單因素方差分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清中淀粉樣蛋白A（SAA）標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

通過(guò)ELISA SAA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)5個(gè)濃度梯度的SAA的OD450 nm，利用ELISA Calc回歸/擬合軟件進(jìn)行分析。由圖1可知，擬合直線回歸方程為：Y=0.184 33X+0.001 08，r2=0.999 4，濃度與吸光值線性回歸良好，表明該方法檢測(cè)樣品值可信度較高。

2.2 乳清中淀粉樣蛋白A（SAA）含量

由表1和圖2可知，患輕度乳房炎奶牛乳清中SAA含量為（3.88±0.57） μg/mL，與健康對(duì)照組比較升高顯著（P﹤0.05）；患中、重度乳房炎奶牛乳清中SAA含量較健康對(duì)照組顯著升高（P﹤0.01）。隨著乳房炎病情加重，乳汁體細(xì)胞數(shù)增加，乳清中SAA含量逐漸升高，表明乳腺損傷程度和乳汁體細(xì)胞數(shù)增加與乳清中SAA含量呈正相關(guān)。

3 討論

SAA主要由肝細(xì)胞合成與降解，機(jī)體受到炎癥、感染、損傷等刺激后產(chǎn)生白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等一系列細(xì)胞因子，調(diào)控SAA的合成[4，6-8]。肝內(nèi)合成的SAA釋放入血后，迅速與高密度脂蛋白（HDL）結(jié)合[9]，參與內(nèi)毒素的解毒以及膽固醇的代謝和轉(zhuǎn)移[10]、抑制免疫反應(yīng)[11]、誘導(dǎo)前列腺素I2的合成等多種生理、病理反應(yīng)[12]。有研究表明，奶牛在發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)血清SAA表達(dá)量在急性炎癥時(shí)大量增加，乳房炎發(fā)病時(shí)血清中SAA含量發(fā)生改變[13]。呂英等[14]報(bào)道，人工感染金黃色葡萄球菌引起山羊隱性乳房炎時(shí)，血清SAA在感染后血清中的濃度急劇升高，乳中SAA較感染前顯著升高。楊永新等[15，16]報(bào)道，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌性乳房炎奶牛血漿中SAA的表達(dá)量增加。楊洪森[17]研究表明，家兔乳頭管灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌后引起乳房炎家兔血清中SAA的表達(dá)量增加。

本研究表明，患隱性乳房炎奶牛乳清中SAA含量較健康組顯著升高，且隨著乳房炎病情加重，乳清中SAA含量逐漸升高。究其原因可能與奶牛乳房炎發(fā)病時(shí)乳汁中體細(xì)胞數(shù)量、IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α含量增加，調(diào)控SAA合成增多相關(guān)，且隨著乳房炎病牛癥狀加劇，IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α含量逐漸增加，SAA合成也隨著增多[18，19]。乳清中SAA含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關(guān)性，隨著乳腺損傷程度的加劇、乳汁體細(xì)胞數(shù)的增加、炎性細(xì)胞因子含量的增多，乳清中SAA含量顯著升高。

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