陳麗敏　陳秋潔　陳美清

摘要：6 ℃冷處理尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）半年齡樹苗24 h后，檢測葉片電導(dǎo)率、葉綠素含量、丙二醛含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、POD活性等生理指標(biāo)的變化，進(jìn)行POD同工酶電泳，并用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）檢測了4個(gè)POD基因的轉(zhuǎn)錄變化。結(jié)果表明，與常溫相比，冷處理后尾巨桉的葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和SOD活性無明顯變化；但相對電導(dǎo)率、丙二醛含量和POD活性都有升高，且與常溫下有顯著差異。POD同工酶電泳結(jié)果顯示，冷處理后，L1、L2、L8、L9和L10共5個(gè)酶帶表達(dá)增強(qiáng)；L3、L4、L5、L6、L7共5個(gè)酶帶的表達(dá)明顯受到抑制。實(shí)時(shí)定量PCR檢測POD1、POD2、POD3、POD4基因的轉(zhuǎn)錄變化發(fā)現(xiàn)，低溫處理后4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄明顯被抑制，其轉(zhuǎn)錄水平分別是常溫下的0.21、0.41、0.40和0.21倍。上述結(jié)果表明，低溫脅迫對尾巨桉的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、POD活性、POD同工酶表達(dá)變化和POD基因的轉(zhuǎn)錄水平等指標(biāo)有顯著影響，低溫下這幾個(gè)指標(biāo)的變化幅度可作為篩選耐寒性較強(qiáng)尾巨桉株系的參考。

關(guān)鍵詞：尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）；耐寒性；生理指標(biāo)；POD基因

中圖分類號：S792.39 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3696-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.029

Abstract：Several physiology indexes and transcription level of four POD （peroxidase） genes were detected after half-year-old saplings of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis were treated at 6 ℃ for 24 h. Meanwhile，peroxidase isozymes electrophoresis and transcription levels of 4 peroxidase genes were analyzed. Compared to at room temperature，the content of chlorophyll and soluble protein and SOD activity had no obvious change at 6 ℃.But relative conductivity，MDA content and POD activity increased markedly at low temperature. The expressions of five peroxidase isozymes with medium molecular weights were inhibited， including line3，line4，line5，line6 and line7.The transcriptional levels of POD，POD2，POD3，POD4 gene were detected by the real-time quantitative PCR （qPCR） in which RTEF gene was used as internal reference gene.The results showed that the transcriptional levels of 4 POD genes were significantly inhibited.Normalized transcriptional level of the same genes to one at room temperature，the transcriptional levels of POD1，POD2，POD3 and POD4 genes were 0.21，0.41，0.40 and 0.21，respectively.The results indicated that relative conductivity，MDA content，POD activity，POD isozymes and the transcriptional levels of POD1，POD2，POD3 and POD4 genes could be used as important references to scan eucalyptus strain with cold tolerance.

Key words：Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis；cold tolerance；physiology index；POD gene

桉樹原產(chǎn)澳大利亞，是桃金娘科（Myrtaceae）杯果木屬（Angophora）、傘房屬（Corymbia）和桉屬（Eucalyptus）植物的統(tǒng)稱，有1 039個(gè)種、亞種和變種[1]。桉樹生長速度快、輪伐期短、耐干旱、耐瘦瘠、適應(yīng)性廣，且用途廣泛，經(jīng)濟(jì)效益高，是世界公認(rèn)的三大人工林樹種之一。桉樹在中國南亞熱帶地區(qū)已成為主要造林樹種，并營造了各類試驗(yàn)林和大面積的速生豐產(chǎn)林基地[2]。隨著桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，桉樹種植不斷北移。在北移的過程中，低溫凍害對桉樹擴(kuò)大栽培與速生豐產(chǎn)造成阻礙，桉樹個(gè)體的抗寒性成為主要限制因子[3]。尾巨桉（Eucalyptus urophylla×E. grandis）是重要的紙漿用材樹種，因生長迅速，干形好，已成為中國華南地區(qū)人工林的重要樹種[4]。但其耐寒性不足嚴(yán)重制約推廣栽培?；钚匝醮x、保護(hù)酶表達(dá)和活性變化對桉樹生長、分化等生理過程有顯著的影響[5，6]。試驗(yàn)通過檢測低溫處理對尾巨桉幾種生理指標(biāo)和POD基因轉(zhuǎn)錄的影響，試圖為耐寒性桉樹的早期鑒定、引種、育種等提供理論依據(jù)和實(shí)用的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尾巨桉（無性系32-29）半年齡樹苗。

1.2 冷處理

將人工氣候箱（26±2） ℃中培養(yǎng)的大小一致、長勢良好的樹苗置于（6±1） ℃，16 h光照/8 h黑暗，光照度為50 μmol/（m2·s） 的人工氣候箱中冷處理24 h。剪取近頂芽的第三片完全展開的成熟葉片，依次用自來水、蒸餾水、超純水沖洗干凈，吸去附著的水分后備用。對照組溫度為（26±2） ℃，其他條件與處理組相同。

1.3 酶活性及同工酶電泳

稱取0.2 g葉片，加入2.0 mL磷酸緩沖液（100 mmol/L pH 6.9）冰浴勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心15 min得上清為酶液。用考馬斯亮藍(lán)法檢測酶液蛋白質(zhì)濃度[7]。用愈創(chuàng)木酚法檢測酶活性，以每分鐘ΔA470 nm變化0.01為1個(gè)酶活單位。3 mL反應(yīng)體系：0.25%（V/V）愈創(chuàng)木酚，3 mmol/L H2O2，100 mmol/L pH 6.9磷酸緩沖液，酶液 20 μL。聚丙烯酰胺活性凝膠進(jìn)行同工酶電泳。上樣蛋白質(zhì)量為10 μg，濃縮膠濃度4%，分離膠濃度8%，濃縮電壓2.5 V/cm，分離電壓5 V/cm，染色液為2%聯(lián)苯胺溶液。

1.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

用打孔器取直徑為15 mm的葉盤置于1 mL RNAiso-mate for Plant Tissue中勻漿。再按RNAiso Plus試劑說明書步驟提取總RNA，溶于30 μL RNAase-free H2O。用Nanodrop 2 000 c檢測總RNA質(zhì)量和濃度。在10 μL反應(yīng)體系中分別加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL和總RNA 1 μg，用RNAase-free H2O補(bǔ)齊至10 μL后瞬時(shí)離心混勻，30 ℃反應(yīng)5 min去除殘存的DNA。再在上述反應(yīng)液中加入5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，RT Prime Mix 1 μL和RNAase-free H2O 4 μL，瞬時(shí)離心混勻，37℃反應(yīng)15 min，85℃ 5 s使酶失活，得cDNA保存于 -20 ℃冰箱備用。上述所用試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.5 目的基因選擇及引物設(shè)計(jì)

檢索GenBank，得到AB591334.1和AB591330.1兩個(gè)桉樹POD基因的CDS序列。從The PeroxiBase（http：//peroxibase.toulouse.inra.fr/）數(shù)據(jù)庫所列的巨桉過氧化物酶基因中選擇CDS序列完整的EgrPrx08和EgrPrx09。將基因的CDS序列輸入primer3plus軟件設(shè)計(jì)qPCR引物。用RTEF基因作內(nèi)參基因[8]。

1.6 qPCR擴(kuò)增

取“1.4”所得的cDNA溶液作模板，進(jìn)行qPCR。反應(yīng)儀器為Chromo 4TM System（Bio-Rad）。qPCR反應(yīng)體系25 μL，分別是：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×Conc）12.5 μL，10 μmol/L Primer F 和Primer R各1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 9 s，55 ℃ 9 s，72 ℃ 15 s，延伸后熒光讀數(shù)，共40個(gè)循環(huán)。從70～90 ℃，每升高1 ℃ 熒光讀數(shù)1次，得融鏈曲線。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。設(shè)常溫下基因的表達(dá)量為1，采用相對定量的Pfaffl法[9]，計(jì)算各基因冷處理后的相對表達(dá)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷處理前后尾巨桉生理指標(biāo)變化

與常溫相比，冷處理后尾巨桉的葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和SOD活性無明顯變化；但相對電導(dǎo)率、丙二醛含量和POD活性都有升高，且與常溫下有顯著差異，其中相對電導(dǎo)率和POD活性的變化最為明顯（表1）。

2.2 冷處理前后尾巨桉葉片POD同工酶電泳結(jié)果

從圖1可以看出，冷處理后，分子量位于中間的同工酶（L3～L7）表達(dá)量降低，分子量較小的同工酶（L8～L10）和分子量較大的同工酶（L1和L2）表達(dá)量升高。其中低分子量的同工酶L9的活性增強(qiáng)最為明顯。低溫處理對不同酶帶活性的影響差異明顯。

2.3 基因擴(kuò)增特異性檢測結(jié)果

將4個(gè)POD基因的CDS序列輸入primer3plus軟件設(shè)計(jì)qPCR引物。qPCR得到的融鏈曲線都只有單一的峰，POD1、POD2、POD3和POD4基因擴(kuò)增產(chǎn)物的融鏈溫度分別是86、87、88和87 ℃，說明擴(kuò)增特異性好，無引物二聚體產(chǎn)生（表2）。經(jīng)序列分析，POD1、POD2、POD3和POD4基因擴(kuò)增產(chǎn)物的長度分別為165、194、179和201 bp。

2.4 冷處理前后POD基因表達(dá)變化

設(shè)常溫下相同基因表達(dá)量為1，冷處理后，尾巨桉POD1、POD2、POD3和POD4的表達(dá)均顯著降低，分別為常溫下的0.21、0.41、0.40和0.21倍（圖2）。結(jié)合同工酶電泳結(jié)果分析，POD1、POD2、POD3和POD4基因的表達(dá)受低溫的抑制類似于L3～L7等酶帶活性受低溫的抑制。

3 小結(jié)與討論

與耐寒性較弱的樹種相比，冷處理后耐寒性較強(qiáng)的樹種的可溶性蛋白質(zhì)含量[10]、葉綠素含量和SOD活性明顯升高，相對電導(dǎo)率升高幅度小，丙二醛含量低[11，12]，本試驗(yàn)結(jié)果與已報(bào)道結(jié)果一致。低溫處理后，尾巨桉相對電導(dǎo)率、丙二醛含量和POD活性都有升高，且與常溫下有顯著差異。

冷處理對尾巨桉的POD同工酶表達(dá)有明顯影響，表明這些酶在低溫處理前后發(fā)生了質(zhì)或量的變化。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，低溫處理后尾巨桉POD1、POD2、POD3、POD4基因的轉(zhuǎn)錄明顯被抑制，其轉(zhuǎn)錄水平分別是常溫下的0.21、0.41、0.40和0.21倍。究其原因可能是尾巨桉POD酶同工酶譜帶較多，各條酶帶對低溫處理的應(yīng)答機(jī)制不同，且每個(gè)同工酶對整體酶活性的影響大小不同。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫對尾巨桉的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、POD活性、POD同工酶表達(dá)變化和POD基因的轉(zhuǎn)錄水平等指標(biāo)有顯著影響。檢測低溫處理后這些指標(biāo)的變化情況可作為篩選耐寒性較強(qiáng)尾巨桉株系的重要參考。

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