夏金嬋+何奕昆

摘要：硼是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，當(dāng)土壤中硼的含量過(guò)高時(shí)就會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害，高硼脅迫能夠抑制植物的生長(zhǎng)，降低農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，因此研究植物抗高硼脅迫的分子機(jī)制至關(guān)重要。一氧化氮（NO）作為信號(hào)分子參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及多種脅迫反應(yīng)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)高硼脅迫能夠誘導(dǎo)擬南芥內(nèi)源NO含量的升高，外加NO能夠提高擬南芥對(duì)高硼脅迫的抗性，同時(shí)內(nèi)源NO含量升高的突變體nox1和cue1表現(xiàn)出抗高硼脅迫的表型，而內(nèi)源NO含量低的突變體noa1則表現(xiàn)出高硼處理敏感的表型，為了進(jìn)一步研究NO緩解高硼對(duì)擬南芥的毒害的機(jī)制，測(cè)定在不同處理?xiàng)l件下擬南芥中硼的含量變化。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中硼酸含量的增加擬南芥中硼的含量也增加，而外源或者內(nèi)源NO都能夠降低高硼處理?xiàng)l件下擬南芥中硼的含量，降低對(duì)植物的毒害。因此，高硼脅迫下降低擬南芥體內(nèi)硼的含量是NO緩解高硼毒害的重要方面。

關(guān)鍵詞：擬南芥；硼；nox1/cue1突變體；noa1突變體

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）15-3608-05

Abstract： Boron is an essential micronutrient for plants， when excessively occurs in the growth medium， it becomes toxic to plants， and inhibits plant growth and reduces the quality of crops. Therefore， it is important to research the molecular mechanism of plant resistance to high boron stress. Nitric oxide （NO） as a signaling molecule involved in plant growth and a variety of reactions to stress， and in this study， it is found that high boron induced NO synthesis in Arabidopsis. Endogenous （nox1 and cue1 mutant） or exogenous NO can improve resistance to high boron stress in Aarabidopsis， while low levels of endogenous NO mutant noa1 showed sensitive phenotype to high boron stress. To assess further the molecular mechanism， the boron content under high boron stress in Arabidopsis was measured， and it is showed that NO could decrease boron concentrations in Arabidopsis exposed to high boric acid. As a result，boron toxicity could be alleviated by nitric oxide by decreasing boron acid in Arabidopsis seedlings.

Key words： Arabidopsis；boron；nox1/cue1；noa1

硼是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，不僅影響植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定[1]，而且對(duì)碳水化合物的運(yùn)輸、花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)[2]等方面有所作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，土壤中硼濃度過(guò)高會(huì)影響植物的生長(zhǎng)，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要問(wèn)題[3]。由于硼元素的特殊化學(xué)性質(zhì)，既沒(méi)有氧化還原能力，也不構(gòu)成酶的組成部分，因此人們對(duì)硼的認(rèn)識(shí)是從缺硼的生理試驗(yàn)中推論獲得的，對(duì)其的了解遠(yuǎn)不如其他營(yíng)養(yǎng)元素。在東南亞、中國(guó)東南部，因雨水帶走土壤中的硼造成硼的缺失可通過(guò)施肥彌補(bǔ)；而在半干旱地區(qū)，硼則會(huì)對(duì)植物造成毒害，高硼使葉片的尖部和周邊萎黃等[4]。由于適合作物生長(zhǎng)的硼濃度范圍很窄，且硼的毒害比缺少更嚴(yán)重。因此，了解硼的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用[5]。土壤中硼主要以硼酸或硼酸鹽的形式存在，植物中95%的硼是以硼酸的形式存在。近來(lái)人們對(duì)硼的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究取得了突破性進(jìn)展，鑒定了某些硼的轉(zhuǎn)運(yùn)通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 例如，NIP5、NIP6、BOR1和BOR4，并對(duì)它們的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有了部分了解[6-8]。

一氧化氮（NO）是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、水溶性的氣體活性分子，在生物體中有重要的作用，近年發(fā)現(xiàn)，其在植物中也具有廣泛的生理效應(yīng)，參與植物的生長(zhǎng)和代謝[9]等過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NO可作為一個(gè)信號(hào)分子參與眾多生理反應(yīng)，如植物對(duì)干旱、鹽度、重金屬、紫外線和臭氧等非生物脅迫的反應(yīng)均受NO的調(diào)節(jié)[10，11]；而且NO還參與植物對(duì)病原菌侵染的防御性反應(yīng)，在植物的防御反應(yīng)中，NO可以誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物抵抗病原菌侵染的能力[12]。研究發(fā)現(xiàn)高硼脅迫能夠誘導(dǎo)擬南芥（Arabidopsis thaliana）內(nèi)源NO的含量的升高，外加NO能夠提高擬南芥對(duì)高硼脅迫的抗性，同時(shí)內(nèi)源NO含量升高的突變體nox1和cue1表現(xiàn)出抗高硼脅迫的表型，而內(nèi)源NO含量低的突變體noa1則表現(xiàn)出高硼處理敏感的表型，為了進(jìn)一步研究NO緩解高硼對(duì)擬南芥毒害的機(jī)制，測(cè)定在不同處理?xiàng)l件下擬南芥中硼的含量變化，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中硼酸含量的增加擬南芥中硼的含量也增加，而外源或者內(nèi)源NO都能夠降低高硼處理?xiàng)l件下擬南芥中硼的含量，降低對(duì)植物的毒害?？梢?jiàn)，高硼脅迫下降低擬南芥體內(nèi)硼的含量是NO緩解高硼毒害的重要方面。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長(zhǎng)條件

供試擬南芥（Arabidopsis thaliana）均為Col-0生態(tài)型背景。土壤中培養(yǎng)擬南芥時(shí)，將吸水飽和并經(jīng)4 ℃春化處理2～3 d的種子，均勻播種于用1/3 B5 營(yíng)養(yǎng)液飽和的蛭石基質(zhì)上。培養(yǎng)皿中無(wú)菌培養(yǎng)擬南芥的過(guò)程為：首先消毒種子表面，將適量干燥的擬南芥種子置于1.5 mL小離心管中，先用適量的70%乙醇消毒30 s，再用1 mL 10%～15%的次氯酸鈉溶液（漂白液）浸泡10～15 min，然后用無(wú)菌水漂洗3～5次，置于4 ℃同步化處理2～3 d，均勻地種在1/2 MS的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基含1/2 MS（murashige and skoog salts，Sigma M5519）、1%（W/V）蔗糖和0.8%（W/V）瓊脂（Sigma），點(diǎn)種后用膜將培養(yǎng)皿口封好，放在培養(yǎng)間中培養(yǎng)。高硼處理過(guò)程為：把含硼的1/2 MS培養(yǎng)基滅菌，制成高硼培養(yǎng)基，野生型和突變體在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d，再移到不同濃度的高硼培養(yǎng)基上，觀察表型。培養(yǎng)間的溫度為22 ℃，光照度為100 μmol/（m2 ·s），光周期為16 h光照/8 h黑暗交替[13]。

1.2 硼含量的測(cè)定

用1/2MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 d的野生型和突變體植物，移到含有高硼的培養(yǎng)基上處理，在指定時(shí)間取材，在60 ℃的烘箱里處理7 d使植物干燥。干燥的植物用HNO3消化。再用MS-ICP（安捷倫Agilent 7 500C）測(cè)定材料中硼離子的含量[13]。

1.3 內(nèi)源NO含量的測(cè)定

高硼處理的擬南芥根部在有或者沒(méi)有NO的清除劑cPTIO[0.5 mmol/L，2-（4-carboxyphenyl）-4，4，5，5-tetramethylimidazo-line-1-oxyl-3-oxide]的情況下，在緩沖液中處理15 min （5 mmol/L MES-KOH， pH5.7，0.25 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2），在15 μmol/L NO染料DAF-FM DA（4-amino-5-methylamino-2′，7′-difluorofluorescein diacetate）中處理15 min，最后在去離子水中清洗20 min，洗掉表面附著的染料。用配有CCD（charge coupled device）的熒光顯微鏡（fluorescence stereomicroscope，ZEISS Stemi SV 11），對(duì)材料發(fā)射的熒光進(jìn)行記錄和分析NO的含量。激發(fā)光波長(zhǎng)為495 nm，發(fā)射光（emission images）波長(zhǎng)為515 nm（濾光片），采集圖像的曝光時(shí)間恒定[14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)3次重復(fù)，不同組進(jìn)行司徒登t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高硼脅迫可誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生

已有證據(jù)表明，NO參與許多植物對(duì)脅迫的反應(yīng)過(guò)程，但是NO是否參與了植物對(duì)高硼脅迫的反應(yīng)仍不清楚。為了驗(yàn)證NO是否參與植物在高硼脅迫下的反應(yīng)過(guò)程，用可滲透細(xì)胞膜的NO特異性探針DAF-FM DA染色法，測(cè)定高硼脅迫下擬南芥根部?jī)?nèi)源NO含量的變化。將正常條件下生長(zhǎng)7 d的擬南芥幼苗，轉(zhuǎn)移到含有不同濃度的硼酸培養(yǎng)基上進(jìn)行高硼脅迫處理，并在不同的時(shí)間點(diǎn)取材，用DAF-FM DA染色法測(cè)定擬南芥根中內(nèi)源NO含量的變化。圖1A表明野生型擬南芥在高硼脅迫條件下根部?jī)?nèi)源性NO的含量增加；高硼脅迫誘導(dǎo)擬南芥內(nèi)源性NO含量的增加還表現(xiàn)出與高硼處理時(shí)間正相關(guān)的特性（圖1B）；高硼脅迫表現(xiàn)出對(duì)硼酸濃度的劑量依賴(lài)性特征，熒光強(qiáng)度顯示，在2 mmol/L的硼酸處理時(shí)，擬南芥內(nèi)源性NO的含量約是正常條件下的2倍，在3 mmol/L的硼酸處理時(shí)，擬南芥內(nèi)源性NO的含量約是正常條件下的2.5倍（圖1C）；為了驗(yàn)證所檢測(cè)的熒光是由內(nèi)源性NO產(chǎn)生的，用NO的清除劑cPTIO清除所檢測(cè)到的熒光，借此證明用DAF-FM DA染色顯示的熒光強(qiáng)度的變化。表明NO的清除劑cPTIO能夠清除高硼脅迫誘導(dǎo)擬南芥中所生成的NO，因此染色所得的熒光強(qiáng)度就反映了植物體內(nèi)NO含量的變化，由于在常溫下生長(zhǎng)的擬南芥中NO的含量變化很小，這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了高硼脅迫能夠誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，并且表現(xiàn)出與高硼脅迫處理濃度與時(shí)間正相關(guān)的特征。

2.2 NO提高擬南芥對(duì)高硼脅迫的抗性作用

高硼能夠誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，那么NO是否作為信號(hào)分子參與植物的抗高硼脅迫的反應(yīng)過(guò)程，能否提高植物的抗高硼脅迫的能力，為了進(jìn)一步研究NO在抗高硼脅迫過(guò)程中的作用，研究了外源NO對(duì)擬南芥抗高硼脅迫能力的影響。將消毒的擬南芥種子種在含有6 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基內(nèi)，同時(shí)加入不同濃度的SNP（NO的供體Sodium Nitroprusside，Dihydrate），生長(zhǎng)1個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，在分別加入2 μmol /L SNP或者5 μmol /L SNP培養(yǎng)基中的擬南芥抗高硼脅迫的能力明顯增強(qiáng)，在加入SNP的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的擬南芥明顯好于未加SNP的擬南芥（圖2A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)源NO對(duì)擬南芥抗高硼脅迫能力的影響，選擇了內(nèi)源NO含量高的2個(gè)突變體cue1和nox1，以及內(nèi)源NO含量低的1個(gè)突變體noa1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將消毒的野生型擬南芥和cue1、nox1、noa1突變體的種子分別種在含有3、5 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)20 d后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源NO含量高的2個(gè)突變體cue1和nox1長(zhǎng)勢(shì)明顯比野生型好。在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的cue1和nox1突變體根比野生型的短，而在含有3、5 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基上，cue1和nox1突變體的根比野生型的長(zhǎng)，特別是在3 mmol/L硼酸的處理?xiàng)l件下，野生型的生長(zhǎng)明顯受到了抑制，而cue1和nox1突變體的生長(zhǎng)相對(duì)比較正常，說(shuō)明cue1和nox1突變體抗高硼脅迫的能力比野生型強(qiáng)；而內(nèi)源NO含量低的突變體noa1，在正常條件下noa1的根較野生型的略長(zhǎng)，而在含有3、5 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基上，noa1突變體的根比野生型的短，即表現(xiàn)出敏感的表型，說(shuō)明noa1突變體抗高硼脅迫的能力比野生型的低（圖2B）。另外發(fā)現(xiàn)，上述野生型擬南芥和3種突變體的種子，在不同濃度硼酸的培養(yǎng)基上萌發(fā)率未見(jiàn)明顯差異。同時(shí)測(cè)定了野生型與突變體在高硼脅迫條件下生長(zhǎng)的根長(zhǎng)，將在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 d的野生型擬南芥和cue1、nox1、noa1突變體的幼苗轉(zhuǎn)移到含有不同濃度硼酸的豎直培養(yǎng)基上進(jìn)行處理，10 d后測(cè)定它們的根長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)硼酸可以抑制其根的生長(zhǎng)，而內(nèi)源NO含量高的2個(gè)突變體cue1和nox1在含有2、3 mmol/L硼酸的培養(yǎng)基上的根明顯比野生型的長(zhǎng)，內(nèi)源NO含量低的突變體noa1在含有2、3 mmol/L硼酸的培養(yǎng)基上的根比野生型的稍短（圖2C）。這些結(jié)果都表明NO能夠提高擬南芥對(duì)高硼脅迫的抗性，在擬南芥的抗高硼反應(yīng)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

2.3 NO能夠降低高硼脅迫條件下植物體內(nèi)硼的含量

以上研究表明NO能提高擬南芥對(duì)高硼毒害的抗性。為了進(jìn)一步探討其調(diào)控機(jī)制，檢測(cè)了擬南芥在不同處理?xiàng)l件下植物體中硼含量的變化。首先檢測(cè)了高硼脅迫條件下野生型擬南芥體內(nèi)硼含量的變化，結(jié)果顯示在3 mmol/L高硼處理?xiàng)l件下擬南芥體內(nèi)硼的含量是正常條件下的11倍，這些硼對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抑制作用，同時(shí)也表明高硼脅迫條件下擬南芥體內(nèi)硼的含量是上調(diào)的（圖3A）。值得注意的是在3 mmol/L硼酸處理時(shí)的同時(shí)如果加入2.5 μmol/L的SNP，生長(zhǎng)20 d后擬南芥中的硼含量較未加SNP的植株中硼含量減少8.7%；如果在3 mmol/L的硼酸處理?xiàng)l件下在培養(yǎng)基中加入5 μmol/L的SNP生長(zhǎng)20 d，擬南芥中的硼含量比沒(méi)有加入SNP的3 mmol/L的硼酸處理?xiàng)l件下的擬南芥中硼含量減少12.6%（圖3B），這些結(jié)果表明外源NO能夠降低高硼處理下植物中硼離子的含量，減輕高硼脅迫對(duì)擬南芥的毒害。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上面的結(jié)果，利用2個(gè)內(nèi)源NO含量高的突變體cue1和nox1突變體和1個(gè)內(nèi)源性NO含量低的突變體noa1，測(cè)定它們?cè)诓煌鹚崽幚項(xiàng)l件下內(nèi)部硼含量的變化，研究?jī)?nèi)源NO對(duì)高硼脅迫條件下擬南芥體內(nèi)硼含量的影響，研究發(fā)現(xiàn)，在正常的生長(zhǎng)條件下內(nèi)源NO含量高的突變體cue1和nox1突變體幼苗中硼的含量就比野生型中的低，而內(nèi)源性NO含量低的突變體noa1中硼的含量在正常生長(zhǎng)條件下比野生型中的稍高；在不同濃度的硼酸處理?xiàng)l件下，cue1和nox1突變體中硼的含量也低于野生型，而突變體noa1中硼的含量稍高，與突變體內(nèi)源的NO含量呈正相關(guān)（圖3C）。這可能是NO能夠提高植物對(duì)高硼抗性的重要原因。

3 討論

硼是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素，然而，人們對(duì)硼吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的了解遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他營(yíng)養(yǎng)元素。其適合作物生長(zhǎng)的濃度較窄，硼的過(guò)量和缺少已成為世界關(guān)注的問(wèn)題，硼的缺少可以通過(guò)施肥來(lái)補(bǔ)充，而大量施肥造成硼的過(guò)量，將對(duì)植物造成毒害，抑制作物的生長(zhǎng)，影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，因此，研究植物抗高硼脅迫的分子機(jī)制，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用，以期通過(guò)分子生物學(xué)手段提高作物的抗高硼脅迫的能力。

NO作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育與環(huán)境互作的協(xié)調(diào)過(guò)程中發(fā)揮中樞性的作用，并對(duì)各種脅迫產(chǎn)生應(yīng)答。研究表明，植物對(duì)干旱、高/低溫、鹽度、重金屬、損傷等脅迫的反應(yīng)均受到NO的調(diào)節(jié)[15-17]。NO在調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)和抵抗毒性離子脅迫方面也具有重要作用，研究證明，在毒性離子鎘的脅迫下，植物體產(chǎn)生NO，NO參與了植物對(duì)鎘脅迫的反應(yīng)過(guò)程[18，19]。NO也可提高植物對(duì)銅脅迫的毒害[20]。研究發(fā)現(xiàn)，高硼脅迫能明顯抑制植物的生長(zhǎng)[21，22]，野生型擬南芥在3 mmol/L硼酸的培養(yǎng)基中，根的生長(zhǎng)被抑制了70%，地面部分的生長(zhǎng)也受到明顯的抑制。在擬南芥中高硼脅迫能誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，外加NO的供體SNP能提高擬南芥對(duì)高硼脅迫的抗性，內(nèi)源NO含量高的突變體nox1和cue1，表現(xiàn)出對(duì)高硼脅迫的不敏感表型，而內(nèi)源NO含量低的突變體noa1，則表現(xiàn)出高硼脅迫敏感的表型，上述結(jié)果從外源與內(nèi)源均證明NO能夠提高擬南芥對(duì)高硼脅迫的抗性。擬南芥體內(nèi)硼含量的檢測(cè)結(jié)果表明，外源與內(nèi)源NO都能降低擬南芥體內(nèi)硼的含量，這可能是NO緩解高硼對(duì)植物毒害的重要原因。但是NO降低高硼脅迫條件下植物體中硼的含量是由于抑制了植物對(duì)硼的吸收還是增加了植物對(duì)硼的外排還需要進(jìn)一步研究。另外植物在脅迫條件下一些與抗逆有關(guān)的保護(hù)基因表達(dá)量都會(huì)升高，NO提高植物抗高硼脅迫的能力是否與抗性基因的表達(dá)有關(guān)也需要進(jìn)一步研究。

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