陳　洋，汪　超，高　冰，李冬生，徐　寧，胡　勇*（湖北工業(yè)大學(xué) 食品與制藥學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068）

高耐受性醋酸菌的篩選及發(fā)酵特性研究

陳洋，汪超，高冰，李冬生，徐寧，胡勇*
（湖北工業(yè)大學(xué) 食品與制藥學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068）

從工業(yè)醋醅中分離出5株耐乙醇、耐高溫的產(chǎn)醋酸菌株，利用生理生化試驗和16S rDNA同源序列分析，初步認(rèn)定其為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。通過對其耐乙醇、耐高溫發(fā)酵特性的研究，發(fā)現(xiàn)菌株FY4可耐受體積分?jǐn)?shù)為12%的乙醇和43℃高溫，在30℃和體積分?jǐn)?shù)10%乙醇條件下產(chǎn)酸量達(dá)到最高，為61.2 g/L。在10 L發(fā)酵罐試驗中，菌株FY4的產(chǎn)酸量始終高于醋酸菌AS1.41，在37℃和體積分?jǐn)?shù)10%乙醇條件下，菌株FY4產(chǎn)酸量達(dá)到42.2 g/L，而在此條件下工業(yè)菌株AS1.41幾乎停止產(chǎn)酸。結(jié)果表明菌株FY4具有高耐受性，可產(chǎn)生大量的醋酸，在工業(yè)生產(chǎn)中具有潛在應(yīng)用價值。

巴氏醋桿菌；耐高溫；耐乙醇；篩選；深層發(fā)酵

醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡萄糖氧化桿菌屬（G1uconobocter）是較為常用的醋酸菌屬，前者主要將酒精氧化為醋酸，用于釀醋工業(yè)，后者主要將葡萄糖氧化為葡萄糖酸［1-3］。醋酸菌不僅應(yīng)用于生產(chǎn)葡萄糖酸、食醋、山梨酸，還是乙醇和糖類氧化的生化反應(yīng)的最重要研究對象。目前，醋酸菌在維生素C制造工業(yè)、食醋釀造工業(yè)上都發(fā)揮著重要作用［4-5］。

醋酸菌是釀醋工業(yè)的核心菌種。在釀醋工業(yè)中，最常用的醋酸菌是醋桿菌屬（Acetobacteer），如菌種AS1.41廣泛用于中國工業(yè)醋酸發(fā)酵，其適合的發(fā)酵溫度為28～33℃?，F(xiàn)代釀醋工業(yè)多采用深層發(fā)酵工藝，在此過程中，初始乙醇含量和溫度是發(fā)酵的關(guān)鍵因素。乙醇是醋酸發(fā)酵的底物，并為醋酸菌生長代謝提供能量，當(dāng)乙醇含量超過40 g/L時醋酸菌的生長會受到抑制［6］。乙醇主要影響甚至改變細(xì)胞膜的組織、通透性和質(zhì)子流，導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢和產(chǎn)酸量低［7］。另一方面，溫度是影響醋酸菌生長和代謝的重要因素，是醋酸菌氧化酒精生成乙酸的必要條件。因為發(fā)酵過程是一個熱積累的過程，所以隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)溫度會逐漸超過醋酸菌的最適生長溫度（30℃），溫度過高會使醋酸發(fā)酵的基本酶變性，細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞分散［8］。

在深層發(fā)酵釀醋工藝中，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)一般＞6%，這對醋酸菌的耐乙醇性能具有較大的考驗；在夏季高溫時，控制釀醋溫度為30℃需要花費(fèi)大量的冷卻成本，要克服以上問題，就需要篩選同時能耐受高含量乙醇和高溫的優(yōu)良醋酸菌。NDOYE B等［9］從撒哈拉以南非洲的熱帶產(chǎn)品中篩選出耐受42℃高溫的醋酸菌，利用該菌種進(jìn)行生產(chǎn)極大地降低了釀醋工業(yè)中的冷卻成本問題；PERUMP ULI P等［10］從斯里蘭卡椰子汁醋中篩選出了一株耐40℃高溫的巴氏醋桿菌，該菌種各項特性均適用于椰汁醋的釀造；孫文英等［11］用溴甲酚綠平板法從腐爛水果中成功分離純化出了一株耐體積分?jǐn)?shù)9%乙醇、38℃高溫的醋酸菌，該菌種有較好的應(yīng)用價值。

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的醋醅中篩選出同時具有耐高乙醇、耐高溫和高產(chǎn)酸特性的醋酸菌，利用生理生化試驗和16S rDNA同源序列分析，對其進(jìn)行鑒定和發(fā)酵特性研究。同時，比較該菌種與工業(yè)菌種AS1.41在深層發(fā)酵中的發(fā)酵特性。為醋酸菌的篩選提供較好的參考價值，為醋酸菌耐受性機(jī)理的研究做好鋪墊工作。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料與試劑

發(fā)酵5～7 d的醋醅：鳳陽醋廠醋醅和丹陽醋廠醋醅；醋酸菌AS1.41：中國典型微生物保藏中心；無水乙醇、氫氧化鈉（NaOH）、碳酸鈣、酚酞、葡萄糖、瓊脂、瓊脂糖等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonuc1eic acid，DNA）提取試劑盒和膠回收試劑盒：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

耐乙醇篩選培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，MgSO40.01%，CaCO32%，瓊脂2%，乙醇10%，pH自然。

富集培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，MgSO40.01%，pH自然。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉2%，MgSO40.01%，乙醇4%。

碳酸鈣平板培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，CaCO32%，瓊脂2%。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；I8雙光束紫外可見分光光度計：濟(jì)南海能儀器有限公司；DYY-7C電泳儀：北京市六一儀器廠；FY50高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；D3024R臺式高速冷凍微量離心機(jī)、TC-XP基因擴(kuò)增儀：杭州博日科技有限公司；FR-200A型凝膠成像儀：上海實驗儀器廠有限公司；SY-3010發(fā)酵罐：上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌株的富集培養(yǎng)

取醋醅各1g，加入100mL蒸餾水中，30℃培養(yǎng)3～5 d，取自然發(fā)酵液5 mL，裝入含有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，即可得到菌株的富集培養(yǎng)液。

1.3.2菌株的定性試驗

取含有菌體的富集培養(yǎng)液20 mL，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，離心除去醋酸菌發(fā)酵液中的菌體，取上清液5 mL，用2.5 mo1/L的NaOH溶液中和至pH 7.0，加入質(zhì)量濃度50 g/L的氯化鐵溶液4～6滴搖勻，觀察溶液是否變成黃褐色，再加熱至沸騰，如出現(xiàn)紅褐色沉淀則菌種確定為產(chǎn)醋酸菌［12］。

1.3.3耐高乙醇、耐高溫醋酸菌的初步篩選

取含有醋酸菌的富集培養(yǎng)液1 mL，用生理鹽水依次稀釋到10-6，分別取200 μL 10-5和10-6的稀釋液涂布于含有體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的碳酸鈣平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72 h，挑出產(chǎn)生透明圈的單個菌落，即可得到耐體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的菌株。對篩選出的耐乙醇菌株進(jìn)行耐高溫研究。

1.3.4生理生化試驗

醋酸菌的生理生化試驗參照伯杰士細(xì)菌鑒定手冊（第八版）。

1.3.5高耐受性菌株的鑒定

按照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取5株高耐受性菌株的基因組DNA，作為模板。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（po1ymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增的16S rDNA引物為：27 f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3′）和1492 r（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）［13］。電泳確定成功后，委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增序列測序。測序后得到菌種的16S rRNA序列，將得到的16S rRNA序列通過BLAST程序提交，在美國國家生物技術(shù)信息中心（nationa1 center of biotechno1ogy information，NCBI）在線數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列檢索。將目標(biāo)菌株和通過基于局部比對算法的搜索工具（basic 1oca1 a1ignment search too1，BLAST）檢索到的與之具有較高的同源性菌株的16S rDNA序列作最大同源性比較分析，同時利用MEGA 5.0軟件采用相鄰法（neighbor-joining，NJ）［14］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6菌株發(fā)酵性能的測定

耐高溫性能測定：對篩選出的所有單菌落富集培養(yǎng)，取對數(shù)期菌液4 mL加入含有96 mL液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，每種單菌落分別在30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃的搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，每隔24 h測量菌種的生長量OD600nm值及產(chǎn)酸量。

耐乙醇性能測定：分別取對數(shù)期菌液4 mL加入含有96 mL液體培養(yǎng)基（分別含有體積分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%、11%、12%、13%的乙醇）的500 mL錐形瓶中，30℃、180r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔24h測量菌種的生長量OD600nm值和產(chǎn)酸量。

1.3.7發(fā)酵罐發(fā)酵

在10 L發(fā)酵罐中，比較菌株FY4與菌株AS1.41的發(fā)酵性能，溫度設(shè)為30℃或37℃，初始乙醇濃度為4%、6%、8%、10%。攪拌速度120 r/min，溶解氧濃度維持在22%。每隔24 h測定產(chǎn)酸量。

1.3.8菌株生物量及產(chǎn)酸量的測定

菌體密度：使用分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值，用OD600nm值表示菌體生物量。

產(chǎn)酸量測定：取1 mL菌株發(fā)酵液于250 mL三角瓶中，再加入50 mL蒸餾水，加入2滴0.5%的酚酞作指示劑，然后用標(biāo)定的0.1 mo1/L NaOH溶液滴定至淺粉色，30 s不變色，即達(dá)到滴定終點(diǎn)，產(chǎn)酸量計算公式如下（以醋酸計）：

式中：V為發(fā)酵液樣品滴定所有的NaOH溶液的體積，mL；V0為以空白培養(yǎng)基為對照滴定所用NaOH溶液的體積，mL；CNaOH為NaOH溶液的物質(zhì)量濃度，mo1/L；V樣為樣品的體積，mL；60為醋酸的分子質(zhì)量，g/mo1。

2　結(jié)果與分析

2.1高耐受性菌株的初步篩選

經(jīng)過醋酸菌的定性試驗，找出含有醋酸菌的富集培養(yǎng)液，將稀釋后的富集培養(yǎng)液涂在含有體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的碳酸鈣平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，有大量的單菌落產(chǎn)生了透明圈，這表明這些菌株在體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇培養(yǎng)基中仍然能生長及產(chǎn)酸。透明圈越大表明菌株對乙醇的耐受能力越強(qiáng)。因此，挑出透明圈上的菌種進(jìn)行平板劃線純化，最終共篩出14株耐體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的菌株。

圖1　耐乙醇菌株篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of ethanol-tolerant strain

對篩選出的14株耐乙醇菌株進(jìn)行耐高溫篩選，結(jié)果如表1所示。

表1　5株菌耐受性試驗結(jié)果Table 1 Tolerance experiment results of five strains

由表1可知，共篩出5株耐體積分?jǐn)?shù)10%乙醇、耐37℃高溫的菌株，分別命名為菌株FY1、FY2、FY3、FY4和FY5。培養(yǎng)溫度為30℃時，F(xiàn)Y3和FY4可以在含有12%乙醇的培養(yǎng)基上正常生長，菌株FY1和FY5可在含有11%乙醇的培養(yǎng)基上正常生長。培養(yǎng)溫度為37℃時，F(xiàn)Y4在含有體積分?jǐn)?shù)12%乙醇的培養(yǎng)基上可微弱生長，菌株FY3和FY4在含有體積分?jǐn)?shù)11%乙醇的培養(yǎng)基上可以正常生長，菌株FY1和FY5在含有體積分?jǐn)?shù)11%乙醇的培養(yǎng)基上幾乎停止生長，菌株FY2僅可以耐受體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇。因此，5株菌種中，菌株FY4的耐受性最強(qiáng)，它可以同時耐受體積分?jǐn)?shù)11%的乙醇和37℃高溫。

2.2生理生化試驗

為了初步確定5株菌種的種屬關(guān)系，根據(jù)伯杰士細(xì)菌鑒定手冊（第八版）中醋酸菌的生理生化特征的描述，對5株菌種的生理生化特征進(jìn)行了測試，結(jié)果如表2所示。

表2　5菌株及菌株AS1.41的生理生化特性結(jié)果Table 2 Physiological-biochemical characteristics results of five strains and strain AS1.41

由表2可知，5株菌種均為革蘭氏陰性菌種，參照伯杰士細(xì)菌鑒定手冊（第八版）對醋酸菌的分類，以巴氏醋桿菌AS1.41作參照菌株，由表2可以看出，5株菌種所測試的生理生化特征幾乎均與巴氏醋桿菌AS1.41相同。因此，初步認(rèn)定5株菌種均為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.3菌株的鑒定結(jié)果

以提取的5株菌的DNA作為模板，采用引物：27 f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3′）和1492 r（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。

圖25　株菌16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 16S rDNA PCR amplification electrophoretogram of five strains

由圖2可知，通過PCR擴(kuò)增后，可發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物大小約為1 500 bp。5株菌種的PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工進(jìn)行測序，全長為1 452 bp。NCBI對比結(jié)果表明所有篩選的菌株均與巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）序列的相似性＞99%。采用相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析醋酸菌的分類位置。結(jié)果如圖3所示。

圖3　5菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of five strains

由圖3可知，5株篩選所得的醋酸菌均顯示與巴氏醋桿菌具有最親近的關(guān)系。5株篩選所得的醋酸菌與巴氏醋桿菌AS1.41的序列相似性＞99%（菌株FY1、FY2、FY3、FY4 和FY5與巴氏醋桿菌AS1.41的相似性分別為99.18%、99.23%、99.36%、99.32%和99.33%）。因此，菌株FY1、FY2、FY3、FY4和FY5應(yīng)歸屬于巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.4菌株生產(chǎn)性能測定

2.4.1耐高溫性能

考察溫度對5株菌種的生長量OD600 nm和產(chǎn)酸量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　溫度對5株菌OD600 nm（A）和產(chǎn)酸量（B）的影響Fig.4 Effect of temperature on OD600 nm（A）and acetic acid production（B）of five strains

由圖4可知，隨著溫度從30℃升至43℃，菌株FY1的生長量OD600 nm值呈下降趨勢，產(chǎn)酸量逐漸降低；當(dāng)溫度＜37℃，溫度對菌株FY2、FY3、FY4和FY5的生長量OD600 nm值和產(chǎn)酸量影響較小，當(dāng)溫度升至40℃時，菌株FY3和FY4依然保持較高的生長及產(chǎn)酸性能，且在42℃時，菌株FY4依然保持較高的產(chǎn)酸量（33.5 g/L）；在44℃時，所有菌株幾乎不生長，且無產(chǎn)酸量性能。結(jié)果表明，F(xiàn)Y4對溫度的耐受性最強(qiáng)，其最高可耐受43℃的高溫。

2.4.2耐乙醇性能

考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對5株菌的生長量OD600nm值和產(chǎn)酸量的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌株生長量OD600nm值呈下降趨勢，菌種生長受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時，菌株FY1和FY2停止生長，菌株FY3、FY4和FY5依然能夠生長及產(chǎn)酸；菌株FY4的產(chǎn)酸量最大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時可達(dá)61.2 g/L。綜合圖4和圖5，結(jié)果表明，F(xiàn)Y4是耐高溫和耐乙醇最強(qiáng)、產(chǎn)酸量最高的菌株，其可以耐受體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇，43℃的高溫。

圖5　乙醇體積分?jǐn)?shù)對5株菌OD600 nm（A）和產(chǎn)酸量（B）的影響Fig.5 Effect of ethanol content on OD600 nm（A）and producing acid amount（B）of five strains

2.5發(fā)酵罐發(fā)酵

圖6　菌株FY4與AS1.41發(fā)酵特性的比較Fig.6 Comparison of fermentation characteristics of strain FY4 and strain AS1.41

在工業(yè)發(fā)酵的過程中，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)通常低于10%，發(fā)酵的溫度通常不超過37℃，因此，為了探究在復(fù)合條件下菌株FY4的發(fā)酵特性，本研究選取的溫度為30℃和37℃，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%、6%、8%、10%，在該條件下，對菌株FY4和菌株AS1.41在10 L發(fā)酵罐中的產(chǎn)酸性能進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，菌株FY4的產(chǎn)酸量始終大于同一條件下菌株AS1.41的產(chǎn)酸量。在30℃、10%乙醇的條件下，菌株FY4的產(chǎn)酸量是菌株AS1.41的2.86倍，菌株FY4的產(chǎn)酸量達(dá)到最高為62.9 g/L；在37℃、體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇條件下，菌株FY4的產(chǎn)酸量雖然有所降低，但是仍然達(dá)到42.2 g/L，而菌株AS1.41幾乎停止產(chǎn)酸。結(jié)果表明，菌株FY4可以同時耐受高乙醇和高溫，并產(chǎn)生大量的醋酸，該菌株在工業(yè)生產(chǎn)上有潛在的應(yīng)用價值：即可以降低初始乙醇對菌種的抑制作用，還能減少高溫季節(jié)釀醋時的冷卻費(fèi)用。

3　結(jié)論

考慮到中國傳統(tǒng)醋醅中蘊(yùn)含著豐富的醋酸菌資源，運(yùn)用高乙醇碳酸鈣平板從醋醅中定向篩選耐乙醇醋酸菌，進(jìn)一步研究其對溫度的耐受性，初步篩選出具有耐乙醇、耐高溫、高產(chǎn)醋特性的酸菌株。對其進(jìn)行生理生化試驗及16SrDNA測序分析，初步認(rèn)定其為巴氏醋桿菌（Acetobac ter pasteurianus）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株FY4可耐受體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇、43℃高溫，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，溫度為30℃條件下產(chǎn)酸量達(dá)到最高，為61.2 g/L。將菌株FY4的發(fā)酵特性與工業(yè)菌株AS1.41進(jìn)行了對比，在10 L發(fā)酵罐試驗中，菌株FY4的產(chǎn)酸量始終高于菌株AS1.41，在37℃，體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的條件下，菌株FY4產(chǎn)酸量達(dá)到42.2 g/L，而工業(yè)菌株AS1.41在此條件下幾乎停止產(chǎn)酸。這表明菌株FY4具有高的耐受性，可產(chǎn)生大量的醋酸，在工業(yè)生產(chǎn)中有潛在應(yīng)用價值，對高耐受性醋酸菌的篩選具有重要的參考價值，對釀醋工藝的提升有一定的指導(dǎo)意義。

［1］王揚(yáng)，李宏，張建利.醋酸菌分類概要［J］.中國釀造，1991，10（6）：7-10.

［2］白立勇.利用廢啤酒生產(chǎn)啤酒醋及其澄清工藝的研究［D］.濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院碩士論文，2007.

［3］董書閣.蘋果醋、蘋果醋飲料優(yōu)良發(fā)酵菌株的選育及發(fā)酵工藝的優(yōu)化［D］.青島：中國海洋大學(xué)碩士論文，2007.

［4］楊立霞，李錦.醋酸菌在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用［J］.河北化工，2012，35 （4）：35-38.

［5］馮靜，施慶珊，歐陽友生，等.醋酸菌多相分類研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報，2009，36（9）：1390-1396.

［6］ZHENG Y，ZHANG K，WANG C，et a1.Improving acetic acid production ofAcetobacter pasteurianusAC2005 in hawthorn vinegar fermentation by using beer for seed cu1ture［J］.Int J Food Sci Tech，2010，45 （11）:2394-2399.

［7］KRISCH J，SZAJANI B.Ethano1 and acetic acid to1erance in free and immobi1ized ce11s ofSaccharomyces cerevisiaeandAcetobacter aceti［J］. Biotechnol Lett，1997，19（6）:525-528.

［8］DE ORY I，ROMERO LE，CANTERO D.Mode11ing the kinetics of growth ofAcetobacter acetiin discontinuous cu1ture:inf1uence of the temperature of operation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1998，49（2）: 189-193.

［9］NDOYE B，LEBECQUE S，DUBOIS-DAUPHIN R，et a1.Thermo resistant properties of acetic acids bacteria iso1ated from tropica1 products of Sub-Saharan Africa and destined to industria1 vinegar［J］.Enzyme Microb Tech，2006，39（4）:916-923.

［10］PERUMPULI P，WATANABE T，TOYAMA H.Identification and characterization of thermoto1erant acetic acid bacteria strains iso1ated from coconut water vinegar in Sri Lanka［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2014，78（3）:533-541.

［11］孫文瑛，陳雄，王志，等.耐高溫高醇醋酸菌的篩選及其發(fā)酵工藝的初步優(yōu)化［J］.中國釀造，2011，30（1）：44-47.

［12］周幗萍，汪芳安，高冰.醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究［J］.中國釀造，2004，23（6）：18-19.

［13］HIRAISHI A.Direct automated sequencing of 16S rDNA amp1ified by po1ymerase chain reaction from bacteria1 cu1tures without DNA purification［J］.Lett Appl Microbiol，1992，15（5）:210-213.

［14］GONZALEZ A，MAS A.Differentiation of acetic acid bacteria based on sequence ana1ysis of 16S-23S rRNA gene interna1 transcribed spacer sequences［J］.Int J Food Microbiol，2011，147（3）:217-222.

［15］YUAN Y，F(xiàn)ENG F，CHEN L，et a1.Directiona1 iso1ation of ethano1-to1erant acetic acid bacteria from industria1 fermented vinegar［J］.Eur Food Res Technol，2013，236（3）:573-578.

Screening and fermentation characteristics of acetic acid bacteria with ethano1 and high temperature to1erance

CHEN Yang，WANG Chao，GAO Bing，LI Dongsheng，XU Ning，HU Yong* （Hubei Research Center of Food Fermentation Engineering and Techno1ogy，Hubei Co11aborative Innovation Center for Industria1
Fermentation，Co11ege of Food and Pharmacy，Hubei University of Techno1ogy，Wuhan 430068，China）

Five acetic acid-producing strains with ethano1 and high-temperature to1erance were iso1ated from industria1 fermented grains of vinegar. The five strains were identified asAcetobacter pasteurianuspre1iminari1y by physio1ogica1 and biochemica1 experiments and 16S rDNA homo1ogous sequence ana1ysis.In the to1erance experiments of the five strains，the strain FY4 cou1d resist 12%ethano1 and 43℃，and the acid production reached to the maximum of 61.2 g/L under the 30℃and a1coho1 concentration 10%.In the 10 L fermentation tank experiments，the acid production of strain FY4 was a1ways higher than that of strain AS1.41.Under the conditions of 37℃and a1coho1 concentration 10%，the acid production of strain FY4 was 42.2 g/L，and strain AS1.41 a1most stopped producing acid.The resu1t showed that strain FY4 had high to1erance and cou1d produce a 1arge amount of acetic acid.It had potentia1 app1ication va1ue in the industria1 production.

Acetobacter pasteurianus；high-temperature to1erance；ethano1 to1erance；screening；submerged fermentation

TS264.2

A

0254-5071（2015）12-0028-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.007

2015-10-28

湖北省自然科學(xué)基金（2015CFB678），湖北省級教育部門青年人才項目（Q20151412）

陳洋（1988-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物和發(fā)酵工程。

胡勇（1980-），男，講師，博士，研究方向為細(xì)胞工程。