劉曉琳+肖俊文+王曉煒+馬榮+趙祥+阿地力·沙塔爾

摘 要：核桃基腐病已成為影響核桃生產(chǎn)的重要病害之一，為了得到對(duì)核桃基腐病有拮抗作用的拮抗菌株，采用組織分離法，在分離核桃基腐病過程中得到細(xì)菌，利用平板對(duì)峙法，最終篩選得到1株拮抗效果較強(qiáng)的菌株GY-11，對(duì)核桃基腐病的拮抗效果達(dá)到80%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定該拮抗細(xì)菌菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

關(guān)鍵詞：核桃基腐??；拮抗細(xì)菌；篩選；鑒定

中圖分類號(hào)：S436.64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.07.021

Abstract： Walnut stalk rot （Pythium oligandrum） has become one of the important diseases that affect walnut industry in Xinjiang. Antagonistic bacteria strains GY-11 was got from flat confrontation culture， while its bacteriostatic rate was 80% to Pythium oligandrum. The bacterial colony and thalli shape， physiological and biochemistry experiments and determination of the sequence of 16S rDNA of the bacteria had been done. The strain GY-11 was identified as Bacillus subtilis.

Key words： walnut stalk rot； antagonistic bacteria； isolation； identification

核桃（Juglans regia L.） 屬落葉喬木，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹種，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，可制取食用油和制作各種食品[1]。核桃作為新疆的第二大果樹，其種植面積占全疆林果總面積的四分之一[2]，是農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱之一。核桃適生范圍廣，常被栽植于山區(qū)和田園，是重要的用材樹種和生態(tài)樹種[3]。近幾年，新疆核桃種植面積逐漸擴(kuò)大，由于大面積種植單一品種、管理粗放以及栽培模式等原因，病蟲害問題日益增多，尤其是核桃基腐?。≒ythium oligandrum Drechsler），嚴(yán)重制約了核桃的健康發(fā)展。

目前，防治核桃基腐病的方法主要以化學(xué)方法為主，通過大田試驗(yàn)篩選出了咪酰胺等防效較好的藥劑[4]。常規(guī)的化學(xué)藥劑在防治核桃基腐病方面，有經(jīng)濟(jì)、高效和方便等優(yōu)勢(shì)，但其易被環(huán)境污染，不利于打造生態(tài)健康果園。最近幾年通過生防菌株防治果樹病害已成為一種重要的防治手段，目前應(yīng)用較多的拮抗細(xì)菌主要有芽孢桿菌 Bacillus subtilis、假單胞桿菌Pseudomonas spp.、土壤放射桿菌 Agrobacterium radiobacter 等[5]。然而通過拮抗菌株防治核桃基腐病的研究尚未見報(bào)道。因此，篩選出抗菌譜廣、生防活性高及對(duì)環(huán)境安全的新型拮抗細(xì)菌，制備成高效的生防菌劑，對(duì)該病害的防治具有重要意義。本研究從分離核桃基腐病病原菌過程中獲得細(xì)菌，并通過平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選出抑制效果的生防細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行種類鑒定，以期為生防菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：核桃基腐病病原菌由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：核桃基腐病病原菌的培養(yǎng)和拮抗菌株的分離采用PDA培養(yǎng)基；拮抗菌的純化采用NA培養(yǎng)基；拮抗菌的液體培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基；生理生化特性的測(cè)定需要采用耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基、淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基、V.P試驗(yàn)培養(yǎng)基、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基、甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基、卵磷脂酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、菌膜形成試驗(yàn)培養(yǎng)基、接觸酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、需氧性測(cè)定試驗(yàn)培養(yǎng)基。

1.2 拮抗菌株的分離

拮抗菌株的分離采用常規(guī)組織分離法。核桃基腐病病害標(biāo)本采集于新疆和田地區(qū)墨玉縣，在材料的病健交界部位切成5 mm的組織塊，用 75%乙醇消毒30 s、1%次氯酸鈉消毒90 s，無菌水沖洗3次，最后將組織塊放置于 PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，將長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落在NA平板上劃線法純化后，將單菌落于4 ℃保存。

1.3 拮抗菌株的篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法。將上述分離到的細(xì)菌活化培養(yǎng)后，等距離（距離病原菌2 cm左右）劃線至已接種核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照菌絲即將長(zhǎng)滿時(shí)，測(cè)量細(xì)菌菌株與病原菌之間的抑菌帶寬度[6]，計(jì)算抑制率：

抑制率=（對(duì)照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑）/對(duì)照平板菌落直徑×100%

1.4 拮抗菌株在不同時(shí)間段的生長(zhǎng)情況

挑取單菌落接種于含有50 mL NB培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，震蕩培養(yǎng)24 h （28 ℃、180 r·min-1），制成種子液。取盛有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶25個(gè)，分別編號(hào)為0，2，4，6，8， 10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48 h。

取2 mL種子液，接種于50 mL NB 培養(yǎng)基中，180 r·min-1，28 ℃振蕩培養(yǎng)。以滅菌NB培養(yǎng)基為對(duì)照，分別從對(duì)應(yīng)時(shí)間的三角瓶取出培養(yǎng)液，測(cè)定OD600值。根據(jù)測(cè)定數(shù)值繪制生長(zhǎng)曲線[6-7]。

1.5 拮抗菌株的鑒定

1.5.1 菌株形態(tài)學(xué)和生理生化特性測(cè)定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]和《芽孢桿菌屬》[9]中介紹的方法，觀察菌株及菌落形態(tài)，測(cè)定拮抗細(xì)菌的需氧特征、NaCl耐受度、檸檬酸鹽利用、丙二酸鹽利用、接觸酶、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、明膠液化等生理生化指標(biāo)。

用接種針分別挑取24 h培養(yǎng)的菌株，分別接種于PDA、PSA的液體培養(yǎng)基和NB、LB培養(yǎng)基，封口，180 r·min-1，28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值，觀察菌株的最適培養(yǎng)基。

1.5.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 通過試劑盒提取菌株的DNA，采用引物對(duì)63f （5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）和1387r （5'- ACGGCTACCTTGTTACGACT -3'），進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為50 μL： 模板DNA 2.5 μL，引物各2.5 μL，dNTP 4 μL，10×Buffer 5 μL，Taq 聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠成像檢測(cè)，PCR產(chǎn)物由北京天根生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列經(jīng) ClustalX 1.83比對(duì)、校正和編輯后，用MEGA5.0軟件中的NJ法（Neighbor-Joining，鄰接法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，應(yīng)用自展法（bootstrap）檢驗(yàn)系統(tǒng)樹，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。以Amphibacillus xylanus作為外群[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

將分離得到的菌株，通過與核桃基腐病病原菌平板對(duì)峙培養(yǎng)，篩選得到3株拮抗效果較好的細(xì)菌菌株，其中僅有菌株GY-11具有較強(qiáng)的拮抗的效果，抑制率達(dá)到80%。因此，選用菌株GY-11做進(jìn)一步研究。

2.2 拮抗菌株在不同時(shí)間段的生長(zhǎng)情況

菌株GY-11在 NB 培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況（圖1），菌株在0～4 h 生長(zhǎng)較慢，4～10 h 生長(zhǎng)最快，菌株量呈典型的對(duì)數(shù)；在10～30 h的時(shí)間段菌體的生長(zhǎng)量變化不大，達(dá)到穩(wěn)定期；在30～48 h菌株的生長(zhǎng)量有明顯的下降趨勢(shì)，此后進(jìn)入衰亡期。

2.3 拮抗菌株的初步鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特征 菌株在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)存在一定差異，在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，其次是PDA。菌株GY-11在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后觀察，其單菌落為圓形，乳白色，白色邊緣不圓滑似圓形，表層不規(guī)則突起，褶皺明顯。顯微觀察，菌體為桿狀，革蘭氏染色呈現(xiàn)紫色，鞭毛特征不明顯，為革蘭氏陽性菌。

生理生化特性表明：菌株為革蘭氏陽性菌，厭氧菌，有氧條件下生長(zhǎng)微弱；最適的生長(zhǎng)溫度為27 ℃；在含有5%或7%NaCl的液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，鹽度越高，生長(zhǎng)越緩慢，說明菌株耐鹽性一般；不能利用檸檬酸鹽做碳源；菌株過氧化氫試驗(yàn)為陽性反應(yīng)；可使明膠液化；有菌膜形成；甲基紅試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)；V-P試驗(yàn)為紅色，為陽性反應(yīng)（表1）。形態(tài)學(xué)與生理生化特征的鑒定結(jié)果表明，菌株GY-11與芽胞桿菌屬的描述一致。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，Blast結(jié)果表明，菌株與枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis的16S rDNA序列同源性為99%，在GenBank注冊(cè)的序列號(hào)為KP876486。從基于鄰接法構(gòu)建的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可以發(fā)現(xiàn)：菌株GY-11與模式菌株枯草芽孢桿菌（KF496886）聚類在同一大分支內(nèi)（支持率99%），并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征，最終確定菌株GY-11為枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis。

3 結(jié)論與討論

本研究通過常規(guī)組織分離病原菌得到細(xì)菌菌株，利用平板對(duì)峙法，篩選出拮抗菌株GY-11，其拮抗效果達(dá)到80%。利用形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定該拮抗菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

拮抗細(xì)菌防治植物病害是當(dāng)今植病界十分活躍的研究領(lǐng)域之一，并已顯示出良好的應(yīng)用前景[11]。目前用芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，有關(guān)芽孢桿菌在植物生物防治上的應(yīng)用報(bào)道很多，其具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、抗性強(qiáng)、易存活與繁殖以及對(duì)人畜無害、不污染環(huán)境、制劑穩(wěn)定和施用方便等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色食品的要求，且為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障[12]?？莶菅挎邨U菌對(duì)多種植物的多種病害都具有防治作用[13-15]，但是對(duì)核桃基腐病的防治研究未見有報(bào)道。本研究通過試驗(yàn)篩選得到一株對(duì)核桃基腐病病原菌有較好抑制效果的枯草芽孢桿菌菌株GY-11。本研究?jī)H對(duì)拮抗菌株的分類地位和培養(yǎng)時(shí)間開展了研究，后期擬進(jìn)一步開展關(guān)于拮抗菌株的最適碳氮源、最適發(fā)酵條件的研究，以期為該菌株進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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