李海英 王慶苓 張琳 包海軍 張恒

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤且已經(jīng)成為全球癌癥死亡的主要原因之一，并且肺癌發(fā)生率也在不同程度的增長，而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌的80%左右[1,2]。雖然目前手術(shù)、放療、化療為肺癌的主要治療方法，但肺癌患者的長期生存率還是比較低[3]，各種基因調(diào)控、表觀遺傳學(xué)及微環(huán)境的影響在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[4,5]，因此從肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制方面探討進(jìn)一步的診療方案顯得尤為重要。

腫瘤轉(zhuǎn)移基因（metastasis associated gene, MTA）是一個腫瘤候選基因家族，主要包括MTA1、MTA2、MTA3，他們分別與組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）結(jié)合形成NuRD復(fù)合物，使基因組蛋白發(fā)生脫乙?；淖兤渖飳W(xué)行為[6-13]。研究報(bào)道MTA3和BCL-6在漿細(xì)胞淋巴瘤中過表達(dá)，且負(fù)性調(diào)控促進(jìn)漿細(xì)胞分化基因的表達(dá)[14]，而在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和卵巢癌中MTA3的表達(dá)降低[15-17]。在乳腺癌中轉(zhuǎn)染MTA3能夠抑制Snail的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，從而抑制上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]，同時在乳腺上皮細(xì)胞中證實(shí)MTA3能夠抑制Wnt4的轉(zhuǎn)錄活性并抑制其分泌，下調(diào)Wnt4下游靶基因Cylin D1、TGF-3β等的表達(dá)[18]。近期研究證實(shí)小鼠顆粒細(xì)胞中MTA3能夠促進(jìn)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。在子宮非內(nèi)膜樣腺癌中結(jié)果顯示MTA3可以作為一個獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)[20]。

研究結(jié)果顯示在不同腫瘤中MTA3發(fā)揮著相反的作用，之前的研究[21]發(fā)現(xiàn)MTA3在肺癌組織中高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)，同時MTA3能夠調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖，但對肺癌細(xì)胞凋亡的影響未見報(bào)道，本研究首先在肺癌細(xì)胞中檢測MTA3的轉(zhuǎn)染效率，同時應(yīng)用siRNA干擾MTA3后進(jìn)一步探討MTA3在肺癌細(xì)胞系中對凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157購自American Type Culture Collection（Manassas, VA, USA）。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM和1640高糖培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清購自碧云天。干擾RNA購自上海吉瑪，MTA3質(zhì)粒由上海吉瑪構(gòu)建，空載體為pcDNA3.1，目的基因?yàn)閜cDNA3.1-MTA3，轉(zhuǎn)染試劑購自Qiagen。RNA提取購自Invitrogen，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒及PCR引物合成購自Takara?？笲AX、c-Caspase-3、p-PARP、Bcl-2和MTA3單克隆抗體購自CST；β-actin抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購自中杉金橋。BCA法蛋白定量試劑盒購自碧云天，裂解液及超敏發(fā)光試劑盒購自Pierce。流式凋亡檢測試劑盒購自BD。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157使用含有10%的小牛血清DMEM和1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，每2天換1次液，并用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取對數(shù)生長的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染siNC、siMTA3和PC、MTA3，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞[22]。轉(zhuǎn)染序列如下：MTA3的干擾siRNA（siRNAa, 5’-CAGUGUAGAUUAUGUGCAATT-3’）及亂序陰性對照（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’）。每次實(shí)驗(yàn)同一個處理因素設(shè)兩個復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時定量PCR 細(xì)胞提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green法，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，總體積20 μL。擴(kuò)增過程如下：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，40個循環(huán)[23]。β-actin作為內(nèi)參?；蛳鄬Ρ磉_(dá)水平計(jì)算方式如下：ΔCt=Ctgene-Ctreference，增加倍數(shù)用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。每次試驗(yàn)均做3個重復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNC、siMTA3和PC、MTA3，轉(zhuǎn)染48 h后，使用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基終止消化后，將細(xì)胞收集到EP管中，1,000 rpm 4 ℃離心5 min后，去上清。用PBS洗兩遍后每個樣本中加400 μL緩沖液，吹打成單細(xì)胞懸液，后避光加入FITC/Annexin V 10 μL和PI 5 μL染色20 min后上機(jī)檢測。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4 ℃, 12,000 rpm/min, 30 min），提取上清為總蛋白。每個泳道加入總蛋白60 μg，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)?。?0 V, 120 min）到PVDF上。5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h[23]?？笲AX、c-Caspase-3、p-PARP、 Bcl-2、MTA3和β-actin（1：1,000）4 ℃孵育過夜。分別與對應(yīng)的二抗（1：2,000）室溫孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Mean±SD表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTA3在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率 根據(jù)之前發(fā)表研究結(jié)果選取細(xì)胞系A(chǔ)549和H157，同時應(yīng)用干擾效率較為明顯的一對干擾序列進(jìn)一步探討MTA3對凋亡影響[21]。應(yīng)用Western blot和Real-time PCR方法檢測NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H157中MTA3的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示：在A549和H157細(xì)胞中干擾內(nèi)源性MTA3后表達(dá)明顯降低，轉(zhuǎn)染MTA3質(zhì)粒后表達(dá)明顯增高（圖1）。

2.2 MTA3在肺癌細(xì)胞A549和H157中對細(xì)胞凋亡的影響 在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157細(xì)胞中分別上調(diào)和下調(diào)MTA3的表達(dá)，檢測其對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如下所示：肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549轉(zhuǎn)染對照NC后細(xì)胞凋亡率為（9.34±0.13）%，而干擾MTA3后細(xì)胞凋亡率為（12.81±0.39）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.014）。在H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染對照NC后細(xì)胞凋亡率為（12.23±0.23）%，而干擾MTA3后細(xì)胞凋亡率為（15.83±0.16）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.011）。同時，在A549和H157轉(zhuǎn)染MTA3上調(diào)其表達(dá)，能夠輕微抑制細(xì)胞凋亡，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可能與A549和H157細(xì)胞中內(nèi)源性MTA3本身含量有關(guān)，即使上調(diào)MTA3后其表達(dá)增加，但也發(fā)揮不了太多的作用（圖2、圖3）。

2.3 MTA3在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157中對凋亡相關(guān)蛋白的影響 在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157中干擾MTA3后收集細(xì)胞，提取總蛋白，用Western blot方法檢測MTA3及凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL-2、Cleved-Caspase-3、p-PARP等蛋白表達(dá)，干擾MTA3后BAX、Cleved-Caspase-3、p-PARP表達(dá)明顯增加，而BCL-2的表達(dá)明顯降低（圖4）。

圖1 MTA3在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率。A：Western blot方法檢測肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157細(xì)胞中干擾內(nèi)源性MTA3后表達(dá)降低，上調(diào)MTA3后表達(dá)增加；B：Real-time PCR方法檢測肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157細(xì)胞中干擾內(nèi)源性MTA3后表達(dá)降低，上調(diào)MTA3后表達(dá)增加。Fig1 Transfection efficiency of MTA3 in lung cancer cells A549 and H157. A: Western blot showed that the expression level of MTA3 was down after effect SiMTA3 and upexpression after effect MTA3 in both lung cancer cells; B: Real-time PCR showed that the expression level of MTA3 was down after effect SiMTA3 and upexpression after effect MTA3 in both lung cancer cells. NC: negative control; PC: pcDNA3.1.

圖3 流式細(xì)胞儀檢測MTA3對H157細(xì)胞凋亡的影響。A：干擾內(nèi)源性MTA3后凋亡明顯增加；B：轉(zhuǎn)染MTA3質(zhì)粒后凋亡輕微減少。Fig3 Apoptosis rate of cell was detected with tranfection of SiMTA3 and MTA3 in H157. A: Tranfection of SiMTA3 can induce cell apoptosis obviously; B: Tranfection of MTA3 can inhibit cell apoptosis mildly. *: P＜0.05.

圖4 Western blot檢測干擾內(nèi)源性MTA3對凋亡相關(guān)蛋白的影響。在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157細(xì)胞中干擾內(nèi)源性MTA3后凋亡相關(guān)蛋白BAX、p-PARP、c-Caspase-3明顯增加，而Bcl-2的表達(dá)明顯降低。Fig4 Expression of apoptosis related molecules levels in MTA3 depleted A549 and H157cells. Western blot analysis of a series of apoptosis related factors showed the protein levels of BAX, p-PARP,c-Caspase-3 were increased and Bcl-2 expression was decreased after silencing MTA3 in A549 and H157 cells.

3 討論

NSCLC占肺癌的80%左右，是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，已經(jīng)成為腫瘤的首要死亡原因，至今其治療尚無突破性進(jìn)展[1,2]，因此從肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制方面探討進(jìn)一步的診療方案顯得尤為重要。

之前研究報(bào)道MTA3在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中低表達(dá)[12-14]，但在絨毛膜癌中高表達(dá)[24]，在子宮非內(nèi)膜樣腺癌中研究結(jié)果顯示MTA3可以作為一個獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)[17]，我們之前的研究[21]發(fā)現(xiàn)MTA3在肺癌中的表達(dá)明顯高于其癌旁正常組織，且與不良預(yù)后有關(guān)。

在小鼠初級顆粒細(xì)胞中，干擾內(nèi)源性MTA3后Cyclin B1和Cyclin B2表達(dá)降低，抑制細(xì)胞增殖，而轉(zhuǎn)染正義MTA3則取得相反的結(jié)果，這一結(jié)果與我們之前的研究結(jié)果相一致，MTA3在肺癌細(xì)胞系中能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]。但是否MTA3能夠進(jìn)一步影響肺癌細(xì)胞的凋亡，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，我們通過上調(diào)和下調(diào)MTA3后進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測，發(fā)現(xiàn)干擾內(nèi)源性MTA3后細(xì)胞凋亡明顯增加。

BCL-2和BAX是凋亡相關(guān)基因，二者通過形成復(fù)合體發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[25,26]。同時能夠調(diào)控Caspase家族的活化，而Caspase-3是Caspase家族中調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)通路的核心位置，被稱為死亡蛋白酶。多種凋亡刺激因子啟動不同的蛋白酶切割Caspase-3酶原，激活Caspase-3，活化的Caspase-3又進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)切割放大，最終使細(xì)胞走向凋亡[27]。而PARP則是最近研究發(fā)現(xiàn)的Caspase-3的作用底物，活化的Caspase-3降解PARP從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此認(rèn)為，Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[28,29]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157中干擾內(nèi)源性MTA3后PARP、BAX、c-Caspase-3表達(dá)增多，而BCL-2表達(dá)降低，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

因此我們的研究證實(shí)了MTA3在肺癌細(xì)胞系中通過調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，初步探討了MTA3在肺癌細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制，探索防治肺癌進(jìn)展的新靶點(diǎn)。